温阳通络方抗胶原诱导性关节炎小鼠滑膜新生血管形成的机制研究*

殷世云，吴晶金

（云南省中医医院，云南 昆明 650021）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性、对称性关节炎为主要表现的全身炎性免疫病[1]。我国患病率约为0.2%～0.4%[2]，具有较高的致残率，如不及早合理治疗，3年内关节破坏可达70%。在欧美国家，RA年经济负担超过400亿欧元，因此开展干预RA的研究具有重要战略意义。类风湿关节炎的重要病理特征就是滑膜血管翳，新生血管形成在RA进程中扮演重要角色，被认为是疾病由急性向慢性转换的关键环节。本研究旨在以温阳通络方为研究载体，探讨其干预RA新生血管形成的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性 DBA/1小鼠90只，8周龄，体质量（18±3）g，购于北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（京）：2016-0011。饲养于云南中医药大学第一附属医院中心实验室SPF级动物房。实验前先适应性喂养7 d，自由摄食摄水，动物房温度维持在22～24℃，湿度维持在65%～70%。

1.2 药品 牛II型胶原（C II）购自sigma公司；完全弗氏佐剂（CFA）购自BD公司；温阳通络方（主要由附片、桂枝、麻黄、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中药组成），由本院成药房提供。甲氨蝶呤片，通化茂祥制药有限公司（批号：H22022674）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 按随机数字表法将实验动物随机分为甲氨蝶呤组、模型组、空白对照组、温阳通络方高、中、低剂量组，每组5只小鼠。

1.3.2 动物造模 空白对照组小鼠不做处理，其余小鼠均进行造模。实验前1 d配制2 mg/mL的牛II型胶原溶液，置于4℃冷藏过夜。冰浴下与 CFA按照1∶1比例充分混匀，制成乳剂。固定小鼠后，在距鼠尾根部 1 cm处以每只100 μL注射。

1.3.3 给药方法 从致炎第21天开始给药干预，温阳通络方高、中、低剂量组分别以 8.0、4.0、2.0 g/kg温阳通络方水溶液每天灌胃，甲氨蝶呤组按10 mg/kg每周给予甲氨蝶呤水溶液灌胃1次；模型组与空白对照组按10 mL/kg每天给予生理盐水灌胃。实验期间均予SPF级普通饲料。第48天末次灌胃后禁食水，第49天脱臼处死，滑膜组织备测。

1.3.4 滑膜组织的收集 小鼠处死后，仰位固定，置于冰上操作，离断四肢，用冷生理盐水冲洗干净后，沿踝关节上方剪下整个关节囊，一部分常规脱钙包埋，切片备用；一部分新鲜冻存于超低温冰箱。

1.3.5 HE染色 石蜡切片进行常规脱蜡、水化：二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min→无水乙醇10 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→蒸馏水I 5 min→蒸馏水II 5 min。蒸馏水洗涤5 min。苏木素染色16 min，洗去浮色，1%盐酸酒精分化2 s（浓盐酸1 mL加入99 mL的75%无水乙醇中配制）。自来水返蓝。伊红染色10 min，自来水终止显色。梯度酒精脱水10 min，二甲苯透明30 min，中性树胶封片，普通光学显微镜下拍照观察。

1.3.6 滑膜组织的免疫组化检测 对各组实验动物滑膜组织石蜡标本行病理学常规染色，另取切片做免疫组化检测。取各组标本常规脱蜡、水化，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，浸入柠檬酸盐缓冲液中，微波加热至沸腾，中档微波处理10 min，自然泠却，用0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次。3%过氧化氢封闭，避光，室温孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。5%羊血清室温封闭1 h。去除多余的封闭液，加一抗稀释液，4℃冰箱过夜。次日用0.01 mol/L PBST漂洗 5 min×4次。滴加 PV9000试剂 I，37℃孵育 30 min，0.01 M PBST漂洗5 min×3次，滴加PV9000试剂 II，37 ℃孵育 30 min，0.01 mol/L PBST 漂 5 min×4次；滴加DAB显色液，室温避光孵育5 min。蒸馏水冲洗，终止显色。苏木素复染2 min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每组于高倍镜下随机选取6个视野拍照。用HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统分析各组小鼠滑膜组织Ang-2、VEGF表达。

1.3.7 滑膜组织Western blot检测 取各组动物滑膜组织迅速称重，每100 mg样本加入预冷的8倍体积蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制剂：0.4 mM PMSF，1 mM Iodo，1 μM Pepstatin A）匀浆 30 min。提取液 4℃下12 000 r/min离心30 min后取上清，BCA法蛋白定量；PBS调至等体积，加5×SDS上样缓冲液，沸水浴5 min；SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样 20 μg，配胶，将膜于转移液（含甲醇15%）中平衡10 min，80 V转膜120 min后将膜取出，置于含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1 h。取出膜，对应一抗1∶1 000稀释，4℃过夜；TBST洗3次，每次5 min；荧光二抗1∶10 000稀释，室温结合1 h；分别用TBST和PBS各洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY红外双色激光成像系统对Ang-2、VEGF相对表达量进行分析，相关抗体购自美国BD公司。

1.4 数据处理 采用IBM SPSS Statistics 25.0统计软件包进行数据处理，采用均数±标准差（±s）进行统计描述，组间数据比较采用方差分析（ANOVA）。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳通络方对DBA/1小鼠及踝关节肿胀度的影响 造模前（0 d）、造模35 d，各组DBA/1小鼠足趾容积差异无统计学意义；造模48 d，各组足趾容积与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。空白组、甲氨蝶呤组、温阳通络方低、中、高剂量组与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。空白组、模型组、温阳通络方低、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），温阳通络高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 温阳通络方对CIA小鼠踝关节肿胀度的影响（±s，n=5）

表1 温阳通络方对CIA小鼠踝关节肿胀度的影响（±s，n=5）

注：与空白对照组同期比较，**P＜0.01；与模型组同期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与甲氨蝶呤组同期比较，▲▲P＜0.01。

组别空白对照组模型组146.20±4.21 149.60±4.83 153.80±3.42△△▲▲-156.00±5.79 158.00±6.82 352.40±6.73**▲▲甲氨蝶呤组 10 mg/kg 156.60±10.26 158.00±9.35 210.20±6.06**△△剂量 0 d 35 d 48 d-温阳通络方低剂量组 2.0 g/kg 155.00±3.93 157.40±2.07 323.80±43.75**△▲▲温阳通络方中剂量组 4.0 g/kg 148.80±10.71 151.60±11.28 255.20±21.37**△△▲▲温阳通络方高剂量组 8.0 g/kg 162.00±9.67 164.60±9.04 194.60±15.90**△△

2.2 温阳通络方对DBA/1小鼠滑膜组织炎症的影响模型组滑膜组织HE染色提示有大量淋巴细胞浸润及滑膜细胞增生；甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组仅有少量淋巴细胞，未见明显滑膜细胞增生，见图1。

2.3 温阳通络方对DBA/1小鼠滑膜新生血管的影响免疫组化DAB染色，阳性反应呈棕黄色，模型组DBA/1小鼠滑膜组织中有大量Ang-2蛋白表达，甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组中Ang-2蛋白表达水平明显减少（P＜0.01），见图2。

2.4 温阳通络方对DBA/1小鼠滑膜新生血管的影响免疫组化DAB染色，阳性反应呈棕黄色，模型组DBA/1小鼠滑膜组织中有大量VEGF蛋白表达，甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组中VEGF蛋白表达水平明显减少（P＜0.01），见图 3。

2.5 温阳通络方对小鼠滑膜组织Ang-2、VEGF蛋白表达水平的影响 空白组、模型组、甲氨蝶呤组、温阳通络方高、中、低剂量组Ang-2、VEGF蛋白表达水平较模型组明显降低，见图4。

3 讨论

温阳通络方是云南省名老中医吴生元教授基于类风湿关节炎“阳虚络痹”理论总结出的效验方，已开发为院内制剂在中医医疗集团50余家单位使用10余年，该方主要由附片、桂枝、麻黄、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中药组成，具有温经通络、散寒止痛之功，主治类风湿关节炎寒湿痹阻或风寒湿痹证。《中藏经》有：“阳者生之本，阴者死之基，阴宜长损，阳宜长益，顺阳者生，逆阳者死”“阳化气，阴成形”，阳气周流，自然百病不作。阳衰阴长，风寒湿乘虚侵袭，具体表现在有形阴邪积聚——即大量滑膜新生血管形成。因此，阳虚邪乘，络脉痹阻可能是滑膜新生血管形成的病机所在。前期临床研究显示，温阳通络方能改善RA患者证候积分及 DAS28、CDAI、SDAI等评分[3-6]，总有效率93.57%；实验研究显示其具有抗炎、镇痛、调节免疫等作用[7-12]。

RA滑膜血管翳富集大量炎症细胞及因子，同时也阻断了关节软骨营养吸收，在关节病变的发生发展中发挥重要作用。因此，抗滑膜新生血管形成可能是RA治疗的新思路[13-16]。其他学者研究发现RA滑膜纤维母细胞以及吞噬样细胞能够较高水平的表达VEGF[17-20]，该因子是滑膜血管翳形成过程中的重要调节因子，而Ang-2对血管新生具有双重作用，当滑膜中VEGF含量丰富时，Ang-2抑制Tie-2受体磷酸化，促进血管的新生和增生[21-22]。

本次研究提示温阳通络方能抑制胶原诱导性关节炎小鼠滑膜新生血管形成，其作用可能与下调滑膜组织Ang-2、VEGF蛋白表达水平有关，进而减轻血管翳形成，有关作用机制还需进一步深入研究。