高效液相色谱法测定化妆品中非法使用人表皮生长因子*

2021-02-23沈少浔刘冰莹

广州化工 2021年3期

吴震，沈少浔，刘冰莹

(国家药品监督管理局化妆品安全风险评估重点实验室，广东省药品检验所，广东广州 510663)

前文《酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子》介绍了为有效识别和防控化妆品中非法使用EGF的风险，先采用ELISA快速筛查出疑似样品，再用HPLC方法进一步定量和确证的策略[1-6]。利用高效液相色谱方法简便、准确、与ELISA方法原理互补的优势，本工作通过HPLC分离，二极管阵列检测器检测建立了对化妆品中非法使用的EGF测定方法。

1 实验

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20 AT带二极管阵列检测器HPLC；METTLER XS205DU电子天平；Eppendorf 5810R离心机。

牛血清蛋白(BSA，生物试剂，先确认对EGF检测无干扰)；氯化钠(分析纯)；乙腈、三氟乙酸(TFA)(色谱纯)；0.4%的BSA氯化钠溶液：取0.4 g的BSA加氯化钠30 g加水100 mL溶解经滤膜过滤；一级实验用水；0.22 μm PTFE滤膜。对照品：上海普欣，重组人表皮生长因子GMP-105-04，批号EGMP10504062，含量98.82%；阳性对照样品：上海昊海生物，外用重组人表皮生长因子，批号20180826-2；桂林华诺威基因，重组人表皮因子滴眼液，批号201908089C。样品：来源于网络购买、国家化妆品监督抽检、广东省化妆品风险监测的化妆品共36个品种，其中冻干粉剂13个，水剂15个，啫喱剂8个。

1.2 色谱条件

CAPCELL PAK C18MGⅡ(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；柱温：30 ℃；进样量：100 μL；监视波长：210～400 nm；特征波长：278 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A为0.1% TFA溶液，B为0.1% TFA乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～15 min时A由95%至60%，15～16 min时A由60%至0%，保持6 min。

1.3 实验方法

对于冻干粉剂：称取混匀后的样品，按每10 mg加入1 mL的0.2% BSA溶液溶解，过滤，必要时稀释备用；对于水剂：取样品0.5 g加入0.5 mL的0.4% BSA氯化钠溶液溶解，过滤，必要时稀释备用；对于啫喱剂：称取样品0.5 g加入0.5 mL的0.4% BSA氯化钠溶液，混匀，必要时以4000 r/min离心15 min，取水层过滤，必要时稀释备用。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

实验考察了Agilent Zorbax SB C18(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)和SHISEIDO CAPCELL PAK MGⅡ C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色谱柱对EGF的分离效果，结果表明均可以实现BSA杂峰和EGF的良好分离，且EGF峰形良好。实验色谱条件对色谱柱的影响很小，研究过程中连续30天使用同一色谱柱分析超过400次样品，证实对色谱柱并没有明显损伤。

2.2 EGF的稳定性和吸附性

EGF在实验室环境条件下不太稳定性，且在液相色谱系统中吸附严重，会极大干扰检测结果。研究发现使用恒定高浓度的BSA溶液作为提取溶液，可以使低浓度EGF在4 ℃时至少保持3天稳定，而且可以极大地抑制EGF的吸附。这可能是由于BSA与EGF结构和性质相似而出现了竞争反应，相对极高浓度的BSA抑制了EGF的分解速度，并使EGF的吸附量减少。实验过程中发现如果进样溶液中BSA的浓度突然减小，EGF会出现解吸附的现象，因此进样溶液的BSA的浓度须保持稳定。研究比较EGF在尼龙、聚砜醚和聚四氟乙烯三种材质滤膜上的吸附，发现PTFE材质中EGF的吸附效应最小，符合使用要求。

研究发现EGF在水溶液中溶解良好，在有机溶剂中溶解性能下降。在比较了水、PBS缓冲溶液、饱和氯化钠溶液、乙腈溶液及pH值对提取效果的影响后，发现对于冻干粉剂化妆品，利用自身缓冲性，用BSA水溶液合适；为降低体系粘度和干扰物质的影响，对于水剂和啫喱剂型化妆品选用BSA的氯化钠溶液较合适。

2.3 标准曲线和检出下限

将EGF溶液和三种基质化妆品的加标溶液按实验方法分别稀释为0.5、1、2、5、10 μg/mL的系列标准溶液，按色谱条件进行测定，以浓度和对应的峰面积为坐标绘制标准曲线，结果如表1所示，表明在0.5～10 μg/mL范围内线性关系良好。测试浓度为0.2 μg/mL的EGF标准溶信噪比大于3，相应检出下限为20 ng。

表1 线性回归方程及相关系数

2.4 精密度和回收率

选取不同基质空白化妆品进行不同浓度水平的加标回收试验，平行测定6次，回收率和RSD结果见表2，表明回收率88.0%～106.6%，相对标准偏差0.2%～5.9%。

表2 精密度和回收率结果(n=6)

2.5 样品分析及与ELISA快速筛查方法、免疫斑点方法结果的比较

使用HPLC检测方法分析36个实际化妆品，与ELISA快速筛查结果对比如表3所示，结论基本相符。由于ELISA快速筛查方法的灵敏度比HPLC方法高2个数量级，对于含极低浓度EGF的样品，会出现ELISA快速筛查方法结果阳性但HPLC检测方法结果小于检出限的情况。使用《中国药典》四部中的免疫斑点法比对HPLC方法检测结果，如图1所示，表明免疫斑点法检测结果与HPLC检测方法结果一致(其Y10是阳性对照样品)。