Treg、Breg、DCs PD-L1表达水平与脓毒症患儿病情严重程度及生存情况的关系

于 航 朝鲁门其其格

(内蒙古医科大学附属医院儿童重症监护室,呼和浩特 010020)

脓毒症是由感染导致的一种全身失控性炎症和多器官功能障碍综合征，重症患者常因缺血缺氧和组织灌注不足引发脓毒性休克[1]。脓毒症起病急且患者预后不良，严重可危及生命，若并发急性肺损伤死亡率可高达60%以上。及早对脓毒症患者病情程度及预后进行有效评估并进行针对性治疗可有效改善患者预后，提高患者生存率[2]。脓毒症的发生发展过程涉及炎症反应、感染、免疫及组织损伤等生理病理改变，主要机制是机体感染及免疫抑制导致机体免疫功能障碍[3]。树突状细胞(dendritic cells,DCs)属于抗原呈递细胞，具有激活免疫细胞和活化初始T细胞的作用，可启动免疫应答和诱导免疫耐受，但脓毒症患者是否存在 DCs异常分化以及是否影响T细胞功能需进一步研究[4]。调节性B淋巴细胞(regulatory B lymphocytes，Breg)及调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)作为与免疫应答显著相关的淋巴细胞可调控机体免疫活性[5-6]。两者在免疫相关性疾病如系统性红斑狼疮、银屑病、类风湿关节炎患者体内均异常表达，推测其可能与脓毒症发生发展密切相关。本研究检测并比较不同病情严重程度的脓毒症患者Treg、Breg、DCs PD-L1表达水平，并探讨其与患者预后生存率的关系，旨在为脓毒症诊断、治疗及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选取60例脓毒血症入院患者及同期108例健康体检者作为研究对象，依据急性生理和慢性健康状况评分系统(A-PACHEⅡ)按照脓毒症患者病情严重程度分为中轻度脓毒症组38例(A-PACHEⅡ评分≤20分)和严重脓毒症组(A-PACHEⅡ评分>20分)22例[7]。男性35例，女性25例，年龄7～15岁，平均年龄(11.28±1.41)岁。原发疾病主要包括：肺部感染25例、急性胰腺炎9例、急性腹膜炎8例、多发损伤11例、心肺复苏综合征7例；所有患者治疗7 d后根据患者生存情况分为存活组46例和死亡组14例。健康对照组男性62例，女性46例，年龄8～14岁，平均年龄(11.19±1.25)岁。两组研究对象性别、年龄、BMI指数等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者知情同意。纳入标准：①所有患者均符合美国胸科医师协会/危重病医学会(ACCP/SCCM)关于脓毒症的诊断标准[8]；②所有研究对象入组前均未接受免疫抑制剂、抗感染药物、糖皮质激素等治疗。排除标准：①伴有病毒性肝炎、HIV病毒感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤或免疫缺陷者；②近期使用过免疫抑制剂、抗感染药物、糖皮质激素等治疗者；③临床资料不完整或随访失访者。

1.1.2仪器与试剂 流式细胞仪(型号：Attune NxT，赛默飞世尔)；Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗体、抗人CD38(APC标记)、抗人CD20(FITC标记)、抗人CD24(PE标记)(Abcam中国)。

1.2方法

1.2.1Treg、Breg、DCs PD-L1表达水平检测 分别取健康志愿者及脓毒症患者静脉血5 ml于肝素抗凝管，流式细胞术检测Treg及DCs比例，以及血清Treg、Breg、DCs PD-L1表达。DCs表型测定时依次加入Lin-1-FITC、CD33-PE、PD-L1-APC 抗体3 μl，混匀后室温避光孵育30 min，离心，洗涤，采用设门法标记Lin-CD33+PD-L1+DCs，以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI) 为单位计算DCs Lin-CD33+PD-L1+表达水平。CD20+CD24hiCD38hiBreg水平测定时分别加入抗人CD38(APC标记)、抗人CD20(FITC标记)、抗人CD24(PE标记)，室温避光孵育20 min，离心、洗涤并采用2%多聚甲醛溶液固定，流式细胞术检测Breg占比。以相同方法检测外周血CD4+CD25+CD127lowTreg水平。

2 结果

2.1不同危重程度患者Treg、Breg及DCs PD-L1表达 中轻度脓毒症患者及严重脓毒症患者Treg、DCs PD-L1表达水平均显著高于健康对照组(P<0.001)，Breg水平显著低于健康对照组(P<0.001)，且严重脓毒症患者上述细胞水平与中轻度脓毒症患者差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

2.2不同危重程度患者A-PACHEⅡ评分与死亡率比较 中轻度和严重脓毒症组患者的A-PACHEⅡ评分见表2，严重脓毒症组患者7 d死亡率显著高于中轻度脓毒症组(P<0.05)。

2.3不同预后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表达与A-PACHEⅡ评分比较及相关性分析 不同预后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表达及A-PACHEⅡ评分差异显著(P<0.05)，死亡组患者Treg、DCs PD-L1表达及A-PACHEⅡ评分均显著高于存活组，Breg水平显著低于存活组(P<0.001)；Treg、DCs PD-L1表达与A-PACHEⅡ评分呈显著正相关(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平与A-PACHEⅡ评分呈显著负相关(r=-0.892，P<0.05)，见表3。

2.4Treg、Breg、DCs水平、A-PACHEⅡ评分对脓毒症患者预后诊断的价值 Treg、Breg、DCs PD-L1表达及A-PACHⅡ评分检测诊断脓毒症患者预后的ROC曲线见图1，诊断效能均较高。Treg水平预测预后的ROC AUC为0.896(95%CI：0.748～0.952)，最佳截断值为4.15%，灵敏度、特异度分别为 80.00%、67.50%；Breg水平预测预后的ROC AUC为0.954(95%CI：0.823～0.987)，最佳截断值为1.36%，灵敏度、特异度分别为 87.50%、80.00%；DCs PD-L1表达水平预测预后的ROC AUC为0.923(95%CI：0.785～0.968)，最佳截断值为423.56 MFI，灵敏度、特异度分别为 85.00%、70.00%；A-PACHEⅡ评分预测预后的ROC AUC为0.856(95%CI：0.652～0.923)，最佳截断值为19.87分，灵敏度、特异度分别为75.00%、71.67%。

表1 各组Treg、Breg、DCs PD-L1表达

图1 流式细胞术检测CD4+CD25+CD127lowTreg表达Fig.1 Flow cytometry detection of CD4+CD25+CD127lowTreg expression

表2 不同危重程度患者A-PACHEⅡ评分与死亡率例(%)]

表3 不同预后患者Treg、Breg、DCs PD-L1表达和A-PACHEⅡ评分比较及其相关性分析

图2 ROC曲线分析Fig.2 ROC curve analysis

3 讨论

脓毒症是一种可导致患者死亡的危急重症，死亡原因主要是感染导致多器官衰竭，其中炎症反应及免疫抑制是脓毒症过程的2种重要病理状态[9]。DCs作为一种与免疫抑制相关的重要免疫细胞，其异常表达与脓毒症患者预后不良甚至死亡密切相关，从而导致DCs抗原提呈及T淋巴细胞增殖活化被抑制，最终引发免疫抑制。DCregs作为DCs 的亚群，可诱导Treg产生[10]。ELKE等[11]研究DCregs可通过产生TGF-β、IL-10等负性调控因子对T 细胞活化过程产生明显抑制作用，诱导Treg失活。Lin-CD33+PD-L1+是DCs的重要表型，与脓毒症免疫抑制密切相关。本研究显示，脓毒症患者Lin-CD33+PD-L1+表达比健康志愿者明显升高，说明PD-1水平上升可导致DCs数减少，进一步导致患者免疫功能抑制。而PD-1/PD-L1作为与免疫抑制相关受体及配体，Treg免疫功能的发挥与PD-1/ PD-L1信号通路有重要联系。机体免疫细胞接受免疫刺激后，为阻止T细胞过度激活，CD4+/CD8+细胞表面大量表达PD-1[12]。HOOGENDIJK等[13]研究证实初始 CD4+T细胞在PD-L1的诱导刺激下转为Treg，当PD-L1表达上升后进一步诱导Treg免疫抑制。同时PD-1/PD-L1信号通路具有抑制T细胞的作用，进一步产生反向调节及免疫抑制。因此在脓毒症发生发展过程中，PD-1/PD-L1通路的反向免疫调节功能在诱导Treg分化中发挥重要作用，从而参与脓毒症免疫抑制过程，脓毒症患者体内CD4+/CD8+T 细胞亚群占比明显低于健康志愿者，其会进一步诱导Treg分化，引发免疫抑制。

CD4+CD25+Treg可明显抑制T细胞免疫功能，属于抑制性T细胞亚群，主要抑制CD4+/CD8+T 细胞增殖和活化。王秋卉等[14]研究认为低表达CD127的Treg与脓毒症发生发展相关。本文在其研究基础上发现脓毒症患者CD4+CD25+CD127lowTreg水平显著高于健康对照组，且重度脓毒症患者高表达程度更高(P<0.05)，说明脓毒症患者免疫功能发生抑制，提示可将CD4+CD25+CD127lowTreg细胞比例作为评价脓毒症严重程度的重要指标。CD20+CD24hiCD38hiBreg是B淋巴细胞的重要表型，其表达水平与机体免疫耐受显著相关，其免疫耐受能力的产生主要由于Breg可通过分泌发现，TGF-β及IL-10调节机体免疫应答[15]。研究证实Breg在不同疾病中的表达存在差异，如系统性硬化症患者Breg表达显著降低的同时也会发生表型及功能损伤，且B 淋巴细胞受体受到刺激后抑制P38Mark/STAT3 通路激活[16]。连广琬[17]等研究发现类风湿关节炎患者的CD24hiCD38hiBreg水平显著低于健康志愿者，认为Breg可能通过抑制免疫作用参与免疫性及炎症反应性疾病发生发展。本研究显示，脓毒症患者Breg表达水平与疾病严重程度呈负相关。

APACHEⅡ评分是评价患者病情严重程度的经典指标，广泛适用于各类危重患者。研究证实APACHEⅡ评分与重症患者的死亡风险呈显著正相关[18]。本研究显示，死亡组患者Treg、DCs PD-L1表达水平及A-PACHEⅡ评分均显著高于存活组，Breg水平显著低于存活组(P<0.001)；Treg水平及DCs PD-L1表达水平与A-PACHEⅡ评分呈显著正相关(r=0.885、0.854，P<0.05)，Breg水平与A-PACHEⅡ评分呈显著负相关(r=-0.892，P<0.05)。提示Treg、Breg水平及DCs PD-L1表达水平可作为评估脓毒症患者预后的有效指标。通过ROC曲线进一步分析患者外周血3种细胞水平预后预测的诊断效能，诊断效能均较高(AUC分别为0.896、0.954、0.923)。提示通过检测脓毒症患者Treg、Breg及DCs PD-L1水平可有效评估患者病情严重程度，可将其作为预后预测的重要指标，为脓毒症的临床诊治提供新的靶点和思路。