基于TCGA数据库研究NUF2基因在肝细胞癌中的表达及临床意义①

米宁宁 林延延 曹 洁 张金铎 岳 平 孟文勃

(兰州大学第一临床医学院，兰州 730000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌，占所有类型肝癌的90%以上，近年发病率明显上升[1]。全球范围内超过50%肝癌发生在中国，且东南沿海地区发病率最高。HCC发生发展的主要因素包括肝硬化、病毒性肝炎、黄曲霉素和化学致癌物等，其中，慢性肝炎病毒感染是最重要因素[2-3]。对于无肝硬化和转移的HCC患者，肝切除是目前首选且最有效的方法[4]。但大部分患者就诊时已处于晚期，常合并并发症及伴有远处转移，无法彻底治愈，需根据肿瘤特点、并发症、肿瘤部位和临床表现等多种因素综合分析并进行微创治疗，包括射频消融术、微波消融术、经肝动脉化疗栓塞和肝动脉放疗性栓塞、基因分子靶向治疗如索拉菲尼等[5-6]。血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是当前HCC诊断常用指标，但仍有约30%的HCC患者AFP水平正常。因此，深入研究HCC发生发展的分子机制，寻找高灵敏度的生物学标记物对HCC早期诊断及预后预测具有重要意义。细胞分裂相关基因NUF2具有稳定着丝粒和保证染色体正确分离的作用，可保证细胞有丝分裂过程正常进行[7]。当肿瘤组织中NUF2异常表达，运动蛋白无法形成纺锤体微管附件，纺锤体装配检查点无法被激活，导致染色体分离异常，从而影响正常有丝分裂过程[8]。本研究使用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据集分析NUF2基因在正常肝组织与HCC中的表达差异、与HCC患者临床病理特征的相关性及其与HCC预后的相关性，为进一步研究HCC的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1数据来源 从TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)数据库下载HCC的mRNA表达谱数据，包含50例正常肝组织和374例HCC组织，同时下载其临床相关资料，采用R软件和Perl语言预处理数据。

1.2数据集筛选和差异表达分析 剔除TCGA数据集中临床病理参数不完整及缺乏预后随访资料的样本，仅保留同时包含临床参数和生存数据的样本，利用Wilcoxon秩和检验确定NUF2基因在正常肝组织和HCC组织中的表达差异，采用R软件(3.5.2)的“limma”软件包完成差异分析并绘制差异散点图[9]。

1.3生存分析与临床相关性分析 根据样本中NUF2基因表达的中位值将NUF2分为高表达组和低表达组，采用R软件的“survival”软件包进行生存分析，采用“survminer”软件包绘制生存曲线，单因素和多因素Cox风险模型分析临床参数与HCC预后的关系并计算风险比(hazard ratio,HR)。

1.4基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA) 采用GSEA软件(4.0.2)(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)进行富集分析[10]。采用GSEA网站的MsigDB数据库获取c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt数据集，设置分析置换次数为1 000次,显著富集基因集需满足以下条件：错误发现率(false discovery rates,FDR)<0.25,P<0.05。

2 结果

2.1NUF2在和正常肝组织和HCC组织中的表达差异 HCC组织中NUF2表达显著高于正常肝组织(P<0.05)，见图1。

2.2NUF2基因表达与临床病理特征相关性分析 NUF2表达与HCC患者预后呈显著相关，见图2。

HCC患者5年生存率分别为高表达组37.9%、低表达45.3%。NUF2表达与HCC患者年龄、临床分期、肿瘤分级及T分期显著相关(P<0.05)，与M分期、N分期相关性无统计学意义(P>0.05)，见图3。单因素Cox分析提示病理分期、T分期、M分期及NUF2基因表达水平与HCC预后相关，进一步进行多因素Cox分析，结果显示NUF2高表达是影响HCC患者预后的独立危险因素。见表1。

2.3GSEA分析 GSEA分析结果表明，NUF2基因高表达组HCC样本主要富集于细胞周期、PPAR信号通路、GNRH信号通路(图4)。提示NUF2基因可能参与HCC发生发展的多个生物学过程。

图1 HCC组织和正常肝组织中NUF2 mRNA表达Fig.1 Expression of NUF2 mRNA in HCC tissue and normal liver tissue

图2 NUF2基因mRNA表达与HCC患者预后的相关性Fig.2 Correlation of NUF2 mRNA expression and prognosis in HCC patients

图3 NUF2表达与临床病理特征的关系Fig.3 Relationship between expression of NUF2 and clinicopathological characteristics

图4 GSEA分析NUF2相关富集基因集Fig.4 GSEA analysis of NUF2 relatied enriched gene set with high expression of NUF2

3 讨论

HCC是目前最常见肝脏肿瘤之一，严重影响人们的生命健康，肝切除是目前治疗HCC的首选和最有效方法，但大部分HCC患者就诊时已处于晚期，且常合并并发症或伴有远处转移，无法手术根治，因此，寻找新的分子标志物和治疗靶点有望改善HCC患者预后。本研究采用TCGA肝癌数据库分析正常肝组织与HCC组织中NUF2基因表达差异并分析其表达与预后的关系，发现NUF2高表达组预后明显差于低表达组，单因素、多因素Cox分析表明NUF2基因可作为HCC患者的独立预后因素。GSEA分析结果提示NUF2基因高表达组HCC样本主要富集于细胞周期、PPAR信号通路、GNRH信号通路等。

细胞分裂相关基因NUF2作为NDC80复合体的重要组成部分,参与动粒-微管黏附，涉及细胞有丝分裂和肿瘤发生发展的重要过程，肿瘤组织中NUF2异常表达可诱导有丝分裂细胞异常并导致细胞死亡，从而导致肿瘤[11-12]。研究发现NUF2可促进细胞生长并抑制HCC细胞凋亡[13]。一项针对人骨肉瘤Saos-2细胞的研究表明，沉默NUF2表达可抑制人骨肉瘤Saos-2细胞增殖，有望成为靶向治疗早期治疗骨肉瘤的新策略[14]。通过siRNA干扰沉默技术抑制NUF2基因表达，结果表明NUF2低表达可显著降低肝癌HCCLM3细胞迁移和侵袭[15]。

综上所述，HCC组织中NUF2基因高表达，且与临床病理特征相关，可能是HCC诊断和治疗的潜在生物标志物。本研究的优势在于利用TCGA数据库中肝细胞癌的测序数据，纳入样本多，临床资料比较完整，为后续研究NUF2基因在HCC中的发生机制及相关临床研究提供依据。但不能完全代表NUF2在蛋白水平的表达，后续将采用qPCR、Western blot和免疫组织化学法验证NUF2的表达情况，进一步研究其作用机制，为HCC的基因靶向治疗提供新思路。