miR-140-5p通过调控Wnt1通路对非小细胞肺癌迁移与侵袭能力的影响①

李会荣 钟 秀 王江川 夏峻巍 程德云

(成都市龙泉驿区第一人民医院呼吸科，成都 610100)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC组织学亚型包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，约占肺癌患者比例的85%～90%，严重威胁人类健康[1-2]。由于缺乏有效的检测手段，NSCLC大部分患者错过最佳手术治疗期而进入NSCLC晚期，且5年内生存率仅为15%[3]。目前，分子靶向药物治疗是晚期癌症的主要治疗手段之一[4]。近年来，随着对miRNA 研究的深入，发现miRNA作为肿瘤抑制因子或癌基因在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，是癌症研究领域的热点[5]。miRNA-140-5p是miRNA中的重要一员，近年来大量研究发现miRNA-140-5p在多种肿瘤中发挥抑制作用。WANG等[6]发现，miRNA-140-5p通过靶向抑制TGFBR1基因表达减轻肾母细胞瘤的侵袭性。人Wnt基因定位于染色体12q13，参与调控细胞增殖分化、细胞极性、细胞迁移等，并与人类多个系统肿瘤密切相关[7]。有相关研究显示，miRNA-140-5p通过靶向Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt1来抑制胃癌中的细胞增殖和侵袭[8]。因此推测miR-140-5p可通过靶向Wnt1基因抑制NSCLC的迁移与侵袭。本研究旨在通过探究miR-140-5p与Wnt1基因的靶向关系及其对NSCLC的影响，为临床对NSCLC的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 人NSCLC A549细胞株购自中国科学院上海细胞库；20组NSCLC 肿瘤组织及癌旁组织来自承德市中心医院。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；TRIzol Reagent购自Ambion 公司；TaqMan miRNA反转录试剂盒、TaqMan miRNA定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；反转录试剂盒、PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；Lipofectamine®2000试剂购自美国Invitrogen公司；Matrigel胶和Transwell小室均购自Corning公司；RIPA裂解液购自碧云天公司；本研究所用抗体均购自CST公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司；数码倒置显微镜购自海长方光学仪器公司；PCR仪器、垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将人NSCLC A549细胞接种于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，在5% CO2、37 ℃条件下进行培养，2 d换液1次，细胞长满后传代培养。待细胞状态稳定后再取对数生长期的细胞用于后续试验。

1.2.2RT-PCR检测 消化A549细胞，收集各组细胞以1×106个/管置于1.5 ml离心管，PBS清洗细胞，1 000 r/min离心 5 min，收集细胞沉淀，各离心管加入500 μl预冷TRIzol，通过TRIzol法提取各组细胞总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。引物序列如下：miR-140-5p，F：5′-TGTGTCTCTCTCTGTGTCCTG-3′；R：5′-GGTATCCTGTCCGTGGTTCTA-3′；Wnt1，F：5′-CAACCGAGGCTGTCGAGAAA-3′，R：5′-GGCCGAAGTCAATGTTGTC-G-3′；GAPDH，F：5′-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3′，R：5′-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′。 反应程序为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，40个循环，每个样品设置3个复孔，通过2-ΔΔCt法对PCR结果进行相对定量分析。

1.2.3细胞转染与分组 将A549细胞分为对照组、miR-140-5p组(miR-140-5p过表达)、Wnt1组(Wnt1过表达)和mimic+Wnt1组(共转染)，并按分组情况分别将miR-140-5p mimic和Lv-Wnt1转染至A549细胞。将A549细胞以1×105个/孔培养于6孔板，待其生长密度达到50%时按试剂盒说明转染，48 h后用于后续试验。

1.2.4Transwell检测细胞侵袭 将对数生长期的A549细胞以1×105个/ml接种于200 μl铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室，下室加入600 μl 含10 %FBS的DMEM培养基，继续培养 24 h 后，用棉签擦去基质胶和上室未穿膜细胞，甲醇固定15 min，Giemsa染色20 min，镜下观察结果并计数，重复3次取均值。

1.2.5细胞划痕试验 将转染后各组A549细胞培养于12孔板，待生长至融合后换液，以20 μl无菌Tips枪头画直线，24 h后在显微镜下观察修复情况。划痕愈合率=(即刻划痕面积-24 h后划痕面积)/即刻划痕面积×100%。各组重复测量3次，取平均值。

1.2.6Western blot检测 使用含有PMSF的RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，加入5×loading buffer并经沸水加热变性5 min，电泳分离蛋白后转印蛋白质至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，洗脱后加入一抗并于4℃冰箱孵育过夜，洗脱一抗后加入对应二抗孵育2 h，PBST洗脱后，加入BCL曝光。

1.2.7荧光素酶报告基因检测 应用生物信息学软件Targetscan数据库预测miR-140-5p与Wnt1的靶向关系。构建Wnt1野生型(WT)和突变型(MUT)pGL3-荧光素酶报告载体。将细胞分为WT-Wnt1+miR-140-5p mimic组、WT-Wnt1+miR-140-5p NC组、MUT-Wnt1+miR-140-5p mimic组和MUT-Wnt1+miR-140-5p NC组，将WT-Wnt1 WT、MUT-Wnt1载体分别与miR-140-5p mimic、miR-140-5p NC共转染至A549细胞，48 h后通过荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1NSCLC组织中miR-140-5p与Wnt1基因表达量呈负相关 RT-PCR结果表明，与癌旁组织相比，NSCLC组织中miR-140-5p表达显著降低(P<0.01，图1A)，而Wnt1基因表达显著升高(P<0.01，图1B)。此外，miR-140-5p表达水平与Wnt1基因表达水平呈负相关(r=-0.901,P<0.001，图1C)。

2.2验证miR-140-5p过表达 与对照组相比，mimic-NC组中miR-140-5p 表达无显著变化，而miR-140-5p mimic组中miR-140-5p 表达显著升高(P<0.01，图2A)。与对照组相比，mimic-NC组中Wnt1基因表达无显著变化，而miR-140-5p mimic组中Wnt1基因表达显著降低(P<0.01，图2B)。提示miR-140-5p过表达成功。

图1 miR-140-5p和Wnt1基因的表达情况及相关性Fig.1 Expression and correlation of miR-140-5p and Wnt1 genesNote:**.P<0.01 compared with adjacent tissues group.

2.3miR-140-5p过表达抑制Wnt1基因的表达 与对照组相比，miR-140-5p mimic组中Wnt1基因在RNA和蛋白质水平表达均显著下降(P<0.01)；在Wnt1组中，Wnt1基因在RNA和蛋白质水平表达均显著升高(P<0.01)。与Wnt1组相比，mimic+Wnt1组中Wnt1基因在RNA和蛋白质水平表达均显著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p过表达可抑制Wnt1基因表达。见图3。

2.4miR-140-5p过表达逆转Wnt1诱导的A549细胞迁移能力增强 如图4所示，划痕24 h后，与对照组相比，miR-140-5p组中细胞划痕闭合度显著降低(P<0.01)，而Wnt1组中细胞划痕闭合度显著升高(P<0.01)。与Wnt1组相比，mimic+Wnt1组中细胞划痕闭合度显著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p可抑制A549细胞迁移，Wnt1过表可促进A549细胞迁移，miR-140-5p过表达可逆转Wnt1过表达对A549细胞迁移能力的促进作用。

2.5miR-140-5p过表达逆转Wnt1诱导的A549细胞侵袭能力增强 如图5所示，与对照组相比，miR-140-5p组中细胞侵袭数量显著减少，Wnt1组中细胞侵袭数量显著增多(P<0.01)。而与Wnt1组相比，mimic+Wnt1组中细胞侵袭数量显著减少(P<0.01)。

图2 RT-PCR检测miR-140-5p过表达Fig.2 RT-PCR detection of miR-140-5p overexpression.Note:**.P<0.01 compared with control group.

图3 RT-PCR和Western blot检测各组细胞中Wnt1基因的表达Fig.3 RT-PCR and Western blot detection of Wnt1 gene expression in each group of cellsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

图4 划痕试验检测各组细胞迁移能力Fig.4 Scratch test to detect cell migration ability of each groupNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

图5 Transwell法检测各组细胞的侵袭能力Fig.5 Transwell method to detect invasive ability of each group of cellsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01，compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

提示miR-140-5p可抑制A549细胞侵袭，Wnt1过表可促进A549细胞侵袭，miR-140-5p过表达可逆转Wnt1过表达对A549细胞侵袭能力的促进作用。

2.6miR-140-5p过表达逆转Wnt1诱导的侵袭相关蛋白表达增加 与对照组相比，miR-140-5p组中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.01)，Wnt1组中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.01)。与Wnt1组相比，mimic+Wnt1组中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.01)。提示miR-140-5p过表达可逆转Wnt1过表达诱导的A549细胞中MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表达增加。见图6。

图6 Western blot检测MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表达水平Fig.6 Western blot detection of MMP2,MMP9 and β-catenin protein expression levelsNote:**.P<0.01 compared with control group,##.P<0.01 compared with Wnt1 group.1.Control;2.miR-140-5p；3.Wnt1；4.mimic+Wnt1.

图7 荧光素酶报告检测miR-140-5p与Wnt1基因的靶向关系Fig.7 Luciferase report to detect targeting relationship between miR-140-5p and Wnt1 geneNote:**.P<0.01 compared with Wnt1 WT+miR-140-5p NC group.

2.7miR-140-5p靶向抑制Wnt1基因 如图7所示，Wnt1基因序列上存在miR-140-5p的靶向结合位点。此外，与WT-Wnt1+miR-140-5p NC组相比，WT-Wnt1+miR-140-5p mimic组中荧光强度显著降低(P<0.01)，MUT-Wnt1+miR-140-5p mimic组、MUT-Wnt1+miR-140-5p NC组中荧光强度无显著变化。提示miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表达。

3 讨论

在初诊时多数患者已错失手术时机，因此放化疗、靶向治疗及免疫治疗等成为了晚期肺癌的主要治疗手段，但生存率并不理想[9]。相对于化疗药物，靶向药物治疗不良反应轻、给药便利，已经成为临床上晚期NSCLC治疗的重要手段[10]。miRNA-140-5p是miRNA中的重要一员，其在肿瘤中发挥抑制作用，可减轻癌细胞的侵袭能力[11]。研究发现在NSCLC组织中miRNA-140-5p表达量较低[12]。人Wnt基因定位于染色体12q13，参与调控细胞增殖分化、细胞极性、细胞迁移等，并与人类肿瘤密切相关[7]。有研究表明，Wnt1基因在NSCLC组织中过表达，促进NSCLC的肿瘤进展[13]。同样地，当miRNA-140-5p过表达时，TGFBR1和IGF-1基因表达降低[14]。与既往研究结果相似，本实验结果显示，在NSCLC组织中，miR-140-5p与Wnt1基因表达呈负相关，且miR-140-5p过表达会使Wnt1基因表达水平降低，表明在NSCLC上，miR-140-5p可通过调节Wnt1水平而发挥作用。

miR-140-5p过表达降低了恶性NSCLC细胞的迁移和侵袭特性[15]。研究发现，miR-140-5p通过靶向VEGFA调节NSCLC细胞的迁移和侵袭[11]。Wnt信号通路的激活可增强NSCLC治疗中对顺铂、多西紫杉醇和放射疗法的抗性，且Wnt抑制剂可抑制NSCLC 细胞系增殖[16]。Wnt1基因可促进癌细胞的迁移和侵袭[17]。相关研究显示，miRNA-140-5p通过靶向Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt1抑制胃癌中的细胞增殖和侵袭[8]。与既往研究结果一致，本实验结果显示，miR-140-5p过表达抑制Wnt1基因表达，同时逆转Wnt1基因过表达诱导的A549细胞迁移和侵袭力增强。提示miR-140-5p可通过抑制Wnt1基因表达抑制Wnt1通路下游因子活性调控A549细胞的迁移、侵袭。

为了验证假设，研究组进一步探究了miR-140-5p过表达对Wnt1通路下游基因表达的影响及miR-140-5p与Wnt1的靶向关系。Wnt/β-catenin 信号通路是启动细胞上皮间质转化的主要通路，参与细胞迁移、侵袭和凋亡的调节[18]。研究发现，Wnt1基因可使侵袭相关蛋白MMP2和 MMP9表达增加[19]。当Wnt/β-catenin 通路活性被抑制，MMP2、MMP7、MMP14表达水平降低[20]。ZHAO等[21]研究发现，miR-140-5p过表达下调MMP2、MMP7、β-catenin蛋白表达水平。与既往结果类似，本研究结果显示，miR-140-5p过表达可降低Wnt1诱导的MMP2、MMP9、β-catenin表达；此外miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表达。提示miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因，进而下调MMP2、MMP9、β-catenin表达。

综上所述，miR-140-5p可靶向抑制Wnt1基因表达，抑制Wnt/β-catenin通路活性，进而下调MMP2、MMP9、β-catenin蛋白表达，抑制NSCLC A549细胞的迁移与侵袭。本研究初步探究了miR-140-5p靶向作用于Wnt1基因对NSCLC A549细胞迁移与侵袭的影响，下一步研究组将建立人NSCLC裸鼠原位种植转移模型，进一步探究在动物模型上miR-140-5p对NSCLC的影响。