硫喷妥钠通过MyD88/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞在脂多糖诱导下的免疫反应

陈 刚 何爱萍

(西安医学院第一附属医院麻醉科，西安 710077)

硫喷妥钠作为临床上比较常用的一种经静脉使用的短效巴比妥类麻醉药，具有较高的脂溶性，静脉注射后极易通过血脑屏障，并作用于脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸突触，增加其对递质的敏感性，同时又能阻断兴奋性神经递质对突触的作用，从而降低大脑皮层的兴奋性，抑制维持大脑兴奋和觉醒的上行网状结构激活系统，降低神经生理和脑功能活动，并最终产生全身麻醉作用[1]。近年来国内外研究发现，硫喷妥钠除用于手术麻醉诱导与维持外，还可对免疫功能产生影响。如王军等[2]在通过对比经硫喷妥钠与异丙酚麻醉的胃癌患者发现，使用硫喷妥钠可明显抑制胃癌患者体内炎症因子TNF-α与IL-6浓度。国外学者通过对比不同麻醉药刺激外周单核细胞发现，硫喷妥钠能够激活体内免疫抑制从而维持术后免疫平衡状态[3]。LOOP团队和ICHIYAMA团队[4-5]均发现，硫喷妥钠可以通过抑制NF-κB的活性起到免疫抑制的作用。然而，硫喷妥钠与NF-κB之间具体的作用机制尚不明确。

髓样分化因子(myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)是一种分子质量为34 kD的蛋白质，为NF-κB信号通路中的关键作用分子[6]。研究发现，当机体受到环境中的不良刺激后，通过一系列反应能够释放稳定存在于细胞骨架中的MyD88，使之激活并作为启动下游信号传导的靶分子进入胞质，而处于炎症反应中枢地位的NF-κB随即被活化而转位入细胞核，与相应靶基因中的启动子或增强子的κB位点结合，从而诱导靶基因的转录，启动免疫反应的应答[7]。国内学者邓娟等[8]研究发现，镇静药右美托咪定可明显缓解脂多糖刺激下的小鼠肺组织中异常升高的MyD88与NF-κB蛋白含量。而麻醉药丙泊酚可能通过抑制MyD88的表达下调多糖所诱导的中性粒细胞ROS的释放。以上文献提示MyD88在不同麻醉镇痛药所引起的炎症反应中发挥重要作用，然而，目前尚无关于MyD88在硫喷妥钠所引起的免疫抑制中作用的相关报道。本研究旨在研究硫喷妥钠对巨噬细胞在脂多糖(LPS)诱导下免疫反应，并初步探讨其相关作用机制，以期为硫喷妥钠对围手术期患者的免疫功能影响提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 人外周单核细胞系THP-1细胞(中国科学院细胞生物研究所)；RPMI1640(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(FBS)、双抗青链霉素(Gibco公司，美国)；佛波酯(PMA)、脂多糖(LPS)(Sigma公司，美国)；TRIzol (Invitrogen公司，美国)；RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TaKaRa公司，日本)；HRP标记二抗(北京中杉)；IL-6、TNF-α、IL-10酶联免疫试剂盒(R&D公司，美国)； si-MyD88及对应的阴性对照组(上海瑞赛生物)； CD80-Percp(Biolegend公司，美国)RT-PCR引物合成(上海生工)；p65、p-p65(Abcam,美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养、分化及巨噬细胞鉴定 THP-1为悬浮细胞，常规复苏细胞后接种于含1%双抗、10%FBS的RPMI1640完全培养基中，并置于37℃、5%CO2的恒温培养箱进行培养，传代至3代后选择生长状态良好的细胞用于实验。取处于对数生长期的细胞，调整细胞密度至1×106个/ml，并接种至24孔板，向细胞培养基中加入100 ng/ml的PMA孵育48 h，以诱导悬浮的THP-1单核细胞分化为巨噬细胞。当细胞贴壁后，去除细胞上清液，并用PBS轻轻冲洗3次，以去除未分化细胞及残存PMA。重新加入含1%双抗、10%FBS的RPMI1640完全培养基并通过显微镜观察细胞形态变化。

1.2.2细胞转染及分组 取生长融合至50%的THP-1巨噬细胞，用Opti-MEM培养基调整细胞密度至3×105个/ml，并将si-MyD88及阴性对照序列si-NC分别转入THP-1巨噬细胞中，根据Lipofect-amine3000试剂说明书进行操作，并将转染后的THP-1巨噬细胞记为si-MyD88、si-NC。si-MyD88 转染THP-1巨噬细胞48 h后，荧光显微镜观察显示转染si-MyD88的细胞中可见绿色荧光蛋白，表明转染成功。将细胞分为THP-1组，即无任何处理的THP-1巨噬细胞；抑制组，即si-MyD88组细胞；抑制组对应的阴性对照组，即si-NC组细胞。

1.2.3细胞流式实验 取处于对数生长期的THP-1巨噬细胞并用含硫喷妥钠(0、7.5、15、30 μmol/L)的完全培养基培养24 h后，用1 000 ng/ml的LPS刺激细胞24 h。PBS调整细胞密度至1×105个/ml,取2 ml细胞悬液至流式管中，3 000 r/min离心5 min，弃上清后，加入100 μl的PBS重悬细胞后，加入抗人CD80-FITC抗体，4℃避光孵育30 min后采用流式细胞仪进行检测。

1.2.4ELISA 按1.2.3处理细胞并分组后收集细胞培养上清，3 000 r/min离心5 min，去沉淀，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞中IL-6、TNF-α、IL-10的水平。实验重复3次。

1.2.5RT-PCR实验 收集生长状态良好的si-MyD88组及对应的阴性细胞组细胞，按照TRIzol法提取细胞中总RNA，经酶标仪检测纯度与质量后，根据逆转录试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录合成cDNA，进行RT-PCR反应。在按照RT-PCR配置体系加样后，根据试剂说明书实时定量。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性 6 s，60℃退火，延伸37 s，40个循环。RT-PCR的引物设计如下：MyD88F：5′-CGATAGTTGGCACGTCGTGG-3′,R：5′-GTAGTCGAGTGCGCATGACA-3′;U6F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R：5′-AACGCTTCACGAATTTG-CGT-3′。以U6为内参，2-ΔΔCt法进行相对定量。

1.2.6Western blot实验 收集生长状态良好的si-MyD88组及对应的阴性细胞组细胞，置于冰上，加入RIPA裂解液，裂解30 min，12 000 g/min，4℃离心15 min后取上清液，BCA法进行蛋白定量，按1∶4比例向上清液中加入蛋白上样缓冲液，并于沸水中加热变性10 min。SDS分离胶及浓缩胶配置完成后，加入相应体积的蛋白样品及蛋白marker进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以分离蛋白条带。待电泳结束后，300 mA电流90 min 进行转模，5%脱脂牛奶于室温下封闭2 h后，TBST洗膜3次，每次5 min。加入稀释后的NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶850)、MyD88(1∶800)一抗，于4℃摇床孵育过夜。次日TBST溶液清洗3次，5 min/次，置于HRP标记的二抗(1∶5 000)室温振荡1 h，再次 TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均匀滴加ECL发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照。Image J软件测定条带灰度值，以目标蛋白与内参β-actin的比值作为其相对含量。以上实验重复3次，结果取其平均值。

2 结果

2.1THP-1巨噬细胞的形态鉴定 PMA诱导THP-1细胞分化48 h后，悬浮生长的THP-1单核细胞转为贴壁的巨噬细胞，并从胞体伸出伪足，见图1。

2.2硫喷妥钠抑制THP-1巨噬细胞在LPS诱导下的免疫反应 流式细胞术及ELISA实验结果均表明，单独使用硫喷妥钠处理THP-巨噬细胞时，对THP-1巨噬细胞表面CD80及炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌影响无统计学意义(P>0.05)。当THP-1巨噬细胞预先被不同浓度的硫喷妥钠预处理后，流式细胞术结果显示，与对照组相比，硫喷妥钠能够明显降低THP-1巨噬细胞表面CD80的表达(P<0.05)，且具有浓度依赖性；ELISA实验结果显示，与对照组相比，硫喷妥钠能够明显降低THP-1巨噬细胞对炎症因子IL-6、TNF-α、IL-10的分泌，且以高浓度的硫喷妥钠(30 μmol/L)作用最为显著(P<0.05)，见图2。

2.3硫喷妥钠对 LPS 诱导下的 THP-1 巨噬细胞中MyD88的表达影响 鉴于上述实验结果，本部分实验中选取30 μmol/L的硫喷妥钠对THP-1巨噬细胞进行预处理。RT-PCR实验结果显示，硫喷妥钠能够明显抑制LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中MyD88 mRNA表达(P<0.05)；Western blot实验结果显示，硫喷妥钠能够明显下调LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中MyD88蛋白表达(P<0.05)，见图3。

图1 THP-1细胞形态变化(×200)Fig.1 Morphological changes of THP-1 cells(×200)Note:A.THP-1 monocytes;B.Differentiated THP-1 macrophages.

图2 硫喷妥钠抑制THP-1巨噬细胞在LPS诱导下的免疫反应Fig.2 Thiopental sodium inhibits LPS-induced immune response of THP-1 macrophagesNote:A～B.Flow chart and analysis of effect of thiopental sodium on the expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;C～E stands for effect of thiopental on secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs LPS(+) thiopental sodium(0 μmol/L).

图3 硫喷妥钠对LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中MyD88的表达影响Fig.3 Effect of thiopental sodium on MyD88 expression of LPS-induced THP-1 macrophagesNote:A.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages;B.Effect of thiopental sodium on expression of MyD88 in LPS-induced THP-1 macrophages.*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

图4 THP-1巨噬细胞中MyD88的表达

2.4THP-1巨噬细胞中MyD88的表达 与THP-1组相比，si-MyD88组细胞中MyD88 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)，si-NC细胞中MyD88变化无统计学意义(P>0.05)；Western blot实验结果显示与THP-1组相比，si-MyD88组细胞中MyD88 蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，si-NC细胞变化无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图5 MyD88抑制THP-1巨噬细胞在LPS诱导下的炎症反应Fig.5 MyD88 inhibits LPS-induced inflammatory response of THP-1 macrophagesNote:A.MyD88 affects expression of CD80 on THP-1 macrophages induced by LPS;B～D stands for MyD88 affects secretion of IL-6,TNF-α and IL-10 by THP-1 macrophages induced by LPS.*.P<0.05 vs THP-1 group.

图6 硫喷妥钠抑制LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中NF-κB信号通路磷酸化Fig.6 Thiopental sodium inhibits phosphorylation of NF-κB signaling pathway in LPS-induced THP-1 macrophagesNote:*.P<0.05,LPS(+) thiopental sodium(-) vs LPS(+)thiopental sodium(+).

2.5MyD88抑制THP-1巨噬细胞在LPS诱导下的免疫反应 流式细胞术结果显示，与THP-1组相比，si-MyD88组细胞表面CD80显著下降(P<0.05)，si-NC组细胞变化无统计学意义(P>0.05)；ELISA实验结果显示，与THP-1组相比，si-MyD88组细胞的IL-6、TNF-α、IL-10水平显著降低(P<0.05)，si-NC细胞变化无统计学意义(P>0.05)，见图5。

2.6硫喷妥钠对LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中NF-κB信号通路的影响 Western blot实验结果显示，硫喷妥钠能够明显抑制LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中NF-κB信号通路中p65蛋白的磷酸化(P<0.05)，见图6。

3 讨论

硫喷妥钠作为速效巴比妥类麻醉药，因其具有较高的脂溶性，极易通过血脑屏障，且能够降低脑组织耗氧量并促进脑血管收缩，减少脑血流量，降低颅内压等作用，因此常被用作颅脑手术、脑复苏等必备药品[9]。近年来，越来越多的学者认识到，围手术期患者免疫功能紊乱可诱发一系列术后并发症，如术后伤口愈合不良、癌症患者肿瘤的复发或转移等[1]。因此选择合适的麻醉方法和药品对术后患者的恢复及获得良好预后具有重要意义。

巨噬细胞作为免疫细胞具有多种功能，其即可以作为吞噬细胞以清除病原体及细胞碎片，又可以作为分泌细胞来分泌多种细胞因子、炎症介质等，故其在免疫调节中发挥重要作用[10]。但由于外周血中巨噬细胞数量较少，且分离过程复杂等原因，因此常利用PMA诱导下THP-1单核细胞系分化为巨噬细胞作为体外实验的细胞模型[11-12]。本实验中，利用此方法成功诱导巨噬细胞免疫反应。LPS是革兰性阴性菌外膜的主要组成部分，在生物体内可引起强烈的免疫反应，常被用来刺激巨噬细胞而形成感染和炎症模型[13]。CD80多表达于各种免疫细胞如B细胞、T细胞、巨噬细胞等活化的APC表面，作为免疫系统激活的共同刺激信号参与调节机体各种免疫应答。在机体中，吞噬细胞在受到不良刺激活化后可分泌IL-6、TNF-α、IL-10等多种炎症介质，有研究提示，在炎症损伤的级联反应中，巨噬细胞通过释放大量的IL-6、TNF-α、IL-10等炎症细胞因子入血，形成神经毒性因子并彼此之间相互作用，形成恶性循环，从而导致免疫功能紊乱[14]。

在机体内，活化炎症反应的信号通路众多，其中最重要的通路为TLR4/MyD88/NF-κB信号通路[15]。Toll样受体(Toll like receptor,TLR)为固有天然免疫受体，此类受体广泛分布于生物体中，且主要表达于巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞等表面，可对病原微生物的相关分子模式进行识别、结合并引发一系列信号转导[16]。TLR4是真核生物体内介导LPS应答的主要受体[17]。研究发现，在机体受到LPS刺激时，TLR4位于胞内的TIR区域与MyD88的羧基端相结合，可进一步激活NF-κB信号通路，从而促进各种炎性因子的基因转录[18]。有研究发现，在小鼠体内特异性敲除MyD88基因后，在小鼠腹腔内注射大剂量LPS时，实验组小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10变化无统计学意义，而正常对照组小鼠在4天内均死于严重炎症反应[19]。提示MyD88在LPS引起的免疫应答中起关键作用。RelA(p65)属于NF-κB信号通路中关键作用蛋白，具有调控基因转录活性增强的作用。在炎症反应发生时，IL-6、TNF-α、IL-10等炎症介质及LPS等多种因素可诱导巨噬细胞、血管内皮细胞、肺组织中p65蛋白磷酸化，从而激活NF-κB信号通路，又可促进炎症介质的释放，从而加剧炎症反应[20-21]。本实验发现硫喷妥钠能够明显抑制LPS对THP-1巨噬细胞中MyD88的mRNA及蛋白的表达。在THP-1巨噬细胞，硫喷妥钠可能通过下调细胞中MyD88的表达以抑制细胞对LPS的免疫应答。并且硫喷妥钠能够抑制LPS诱导下的THP-1巨噬细胞中NF-κB信号通路的磷酸化，以抑制信号通路活化。

综上所述，硫喷妥钠能够抑制巨噬细胞在LPS刺激诱导下的免疫反应，其作用机制可能与降低细胞中MyD88/NF-κB信号通路激活水平有关，本研究明确硫喷妥钠在围手术期患者免疫功能中的作用，然而，对于硫喷妥钠在体内免疫系统中的其他作用机制有待进一步研究。