阴道分泌物支原体固体和液体培养基培养结果差异及原因分析

王庆莅，袁美晶，宁丽萍，祝仲珍，赵婉茹，郭 靓，朱皓皞，张益明，王占科

中国人民解放军联勤保障部队第九○八医院检验科，江西南昌 330002

支原体培养假阳性是造成临床对妇科感染误诊、误治的主要原因。支原体是介于细菌和病毒之间的微生物，呈0.1～0.3 μm丝状或杆状，能通过滤菌器，无细胞壁，是目前已知的能独立生存和繁殖的细胞外最小原核细胞微生物。支原体在土壤、动物体和人体中广泛存在，目前已发现150多种[1]。从人体分离出来的支原体有16种，解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)、肺炎支原体、生殖支原体和穿通支原体等5种支原体对人体具有致病性，其中Uu和Mh是造成女性阴道炎、宫颈炎和慢性盆腔炎的常见条件致病菌，可通过性传播，已引起国内外学者的重视[2-3]。Uu和Mh分别具有尿素酶和精氨酸酶生化属性，能分别分解尿素和精氨酸产生氨，使液体培养基pH值升高，导致液体培养基内的酸碱指示剂发生颜色变化(由黄色变为红色)，可以以此原理判断液体培养基中是否存在Uu或Mh[4]。支原体液体培养基尽管添加了抑制其他细菌生长的抗菌药物，但由于某些细菌等非支原体微生物存在耐药现象，支原体液体培养基并不能完全抑制非支原体微生物的生长。如果非支原体微生物也能分解尿素或精氨酸，也同样可以使支原体液体培养基出现阳性，这是造成支原体液体培养基假阳性的主要原因[5]。支原体固体培养基培养Uu和Mh是通过观察Uu和Mh在固体培养基上的单个菌落的特征形态来诊断Uu和Mh感染，将Uu和Mh菌落转接到液体培养基上，可观察Uu和Mh药敏结果。本研究收集妇科炎症患者阴道分泌物标本，同时进行固体培养基培养和液体培养基培养，统计两种方法的阳性率，并分析固体培养基培养阴性但液体培养基培养阳性的原因，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2018年1月至2019年6月在本院妇科就诊的妇科炎症患者其阴道分泌物标本354份。所有就诊患者年龄18～63岁，有不同程度的阴道炎、宫颈炎、附件炎和慢性盆腔炎，并伴有白带增多、异味和腹痛等临床症状，采集阴道分泌物标本时患者最近3 d均未进行过抗菌药物治疗及性生活。

1.2仪器与试剂 阴道分泌物标本支原体固体培养基和液体培养基均由众爱生河北生物科技有限公司生产。SW160型二氧化碳培养箱由上海皓庄仪器有限公司生产，CX31型光学显微镜由日本Olympus公司生产。支原体固体培养基含有促进支原体生长繁殖的营养琼脂、蛋白胨、盐类、小牛血清和细胞生长培养液，以及抗菌药物等；支原体液体培养基含有小牛血清、尿素、精氨酸、酸碱指示剂及多种抗菌药物等。细菌和真菌培养所需培养基由郑州安图生物科技有限公司生产。

1.3标本采集 患者清洗外阴后，用消毒后的无菌棉拭子插入阴道后穹窿处，旋转几周，停留10 s后取出，无菌操作条件下，迅速将含有阴道分泌物的棉拭子放置在无菌干燥试管内，及时送检。

1.4检测方法 阴道分泌物标本同时进行支原体固体培养和液体培养，培养方法严格按照液体和固体培养基试剂盒说明书进行，无菌操作下，将阴道分泌物标本接种在固体培养基和液体培养基上，放在二氧化碳培养箱中培养24～48 h。固体培养基Uu和Mh菌落形态特征通过显微镜观察并记录，液体培养基颜色变化通过肉眼观察并记录。支原体液体培养基培养阳性但固体培养基培养阴性的液体培养基进行细菌和真菌鉴定，以及尿素和精氨酸分解试验，参照文献[5]进行操作。支原体液体培养基培养阴性但固体培养基培养阳性标本再进行液体培养。

1.5结果判读标准 支原体液体培养基由黄色变为红色判定为阴道分泌物标本支原体培养阳性。低倍显微镜下观察固体培养基菌落，菌落中有沙粒状物质，直径为10～50 μm较小的深褐色圆形菌落(菌落中有沙粒状物质)为Uu；直径为100～300 μm较大的油煎蛋状菌落为Mh，见图1。如果固体培养基上出现一种菌落代表接种标本中存在一种支原体感染。如果固体培养基上同时出现两种支原体菌落，说明标本中同时存在Uu和Mh感染。

图1 支原体固体培养基Uu和Mh菌落形态

1.6统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及统计学分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1支原体固体培养基培养结果 354份阴道分泌物标本中固体培养基培养阳性(Uu或Mh阳性)标本为112份，其中单纯Uu阳性86份，阳性率为24.29%；单纯Mh阳性9份，阳性率为2.54%；Uu合并Mh阳性17份，阳性率为4.80%。Uu或Mh阳性率(31.64%)明显高于单纯Mh阳性率及Uu合并Mh阳性率，差异均有统计学意义(χ2=105.75、85.55，P<0.001)； 单纯Uu阳性率与单纯Mh阳性率进行比较，差异有统计学意义(χ2=72.08，P<0.001)； 单纯Uu阳性率与Uu合并Mh阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=54.09，P<0.001)。

2.2支原体液体培养基和固体培养基培养阳性率比较 354份阴道分泌物标本中液体培养基培养阳性标本为145份，培养阳性率为40.96%；固体培养基培养阳性标本112份，培养阳性率为31.64%。液体培养基培养阳性率明显高于固体培养基培养阳性率，差异有统计学意义(χ2=6.65，P<0.001)。

2.3支原体液体培养基和固体培养基培养结果不一致性分析 145份液体培养基培养阳性标本中，35份固体培养基培养阴性，两种培养方法阳性结果不一致率为24.14%。209份液体培养基培养阴性标本中，2份固体培养基培养阳性，两种方法阴性结果不一致率为0.96%。见表1。

表1 354份阴道分泌物标本支原体液体培养基和固体培养基培养情况(n)

2.4支原体液体培养基培养阳性但固体培养基培养阴性标本细菌和真菌鉴定结果 35份支原体液体培养基培养阳性但固体培养基培养阴性标本，将液体培养基转接到细菌和真菌培养基上进行再次培养和鉴定，分离出大肠埃希菌17株，变形杆菌13株，表皮葡萄球菌11株，阴沟肠杆菌4株，新型隐球菌2株，进一步做尿素和精氨酸分解试验，分离出来的细菌和真菌均能分解尿素或精氨酸产生氨。

2.5支原体液体培养基培养阴性但固体培养基培养阳性标本再进行液体培养情况 2份支原体液体培养基培养阴性但固体培养基培养阳性标本，尽管固体培养基阳性，但菌落数均不超过2个，将固体培养基上的单个菌落转接到支原体液体培养基中进行再培养，结果均阳性。

3 讨 论

支原体革兰染色不易着色，姬姆萨染色呈淡紫色，可通过二分裂或出芽方式繁殖，繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35 ℃，最适pH值为7.8～8.0。Uu和Mh一般不进入血液，可存在于女性生殖道黏膜内，通过黏附宿主细胞，获取脂质和胆固醇，使宿主细胞膜损伤，造成局部炎性反应[6]，Uu和Mh作为人体寄生的常见支原体，是导致妇科炎症的主要病原微生物[7-8]。阴道分泌物是检验科微生物实验室常见标本，提高体外培养鉴定阴道分泌物标本Uu和Mh的准确性是微生物检验医学的重要内容，支原体培养结果出现假阳性或假阴性，不仅不能指导临床科室诊断和治疗支原体感染，还可能对妇科患者造成误诊或漏诊。

支原体培养包括固体培养基培养和液体培养基培养[9]，固体培养基培养能通过Uu和Mh的菌落特征准确判断是哪种支原体阳性，液体培养基培养不仅可以培养支原体还可以做药敏试验，不足之处在于液体培养基培养根据Uu和Mh能分解尿素和精氨酸，产生氨，使液体培养基酸碱指示剂变成红色来推测支原体的存在，因而并不能准确区分Uu和Mh阳性，而且任何分解液体培养基中尿素或精氨酸的微生物均可以使液体培养基培养结果呈阳性，导致液体培养基出现假阳性[10]。

支原体固体培养基培养通过菌落形态特征可区分患者阴道分泌物标本是单纯Uu感染、单纯Mh感染，还是Uu合并Mh感染。本研究结果发现，妇科炎症患者单纯Uu阳性率明显高于单纯Mh阳性率，提示Uu是导致妇科炎症的主要支原体类型。Uu合并Mh阳性率高于单纯Mh阳性率，提示Uu合并Mh感染应引起临床重视。为比较阴道分泌物标本支原体液体培养基和固体培养基阳性率，354份标本同时做固体培养基和液体培养基培养结果发现，二者培养结果不一致，液体培养基培养阳性率(40.96%)明显高于固体培养基(31.64%)。如果支原体液体培养基培养为假阳性，会造成临床科室对妇科炎症患者支原体感染的误诊，临床医生按照支原体感染对患者进行治疗，不仅可能无效，而且还会给患者带来不必要的经济负担和心理压力。

为探讨支原体液体培养基和固体培养基培养结果不一致的原因，本研究对35份固体培养基培养阴性但液体培养基培养阳性标本的液体培养基转接进行细菌和真菌鉴定分析，结果发现液体培养基含有能分解尿素或精氨酸的细菌或真菌，主要为大肠埃希菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌和新型隐球菌，这和文献[10-11]的报道基本一致。阴道分泌物标本含有分解尿素和精氨酸的细菌或真菌，是导致支原体液体培养基培养结果假阳性的主要原因，其药敏结果并不是支原体感染的药敏结果，对临床支原体感染诊断和治疗无临床价值。本研究结果还发现，有2份阴道分泌物标本固体培养基培养阳性但液体培养基培养阴性，这种情况比较少见，可能与标本内支原体数量太少导致液体培养基氨生成量不够，颜色变化不明显有关。

固体培养基一个支原体菌落代表一个支原体繁殖出来的聚集体。本研究将2份支原体液体培养基培养阴性但固体培养基培养阳性的菌落转接到液体培养基进行再培养，液体培养基均为阳性结果，提示液体培养基培养阴性但固体培养基培养阳性，并不是固体培养基支原体假阳性，而是液体培养基培养假阴性，提示支原体固体培养基灵敏度可能高于液体培养基灵敏度。支原体固体培养基培养得到阳性结果后，然后再把固体培养基上的支原体菌落转接到液体培养基做药敏试验，是降低液体培养基假阳性结果发生率的重要措施，值得进一步探讨。患者的阴道分泌物含有大量的细菌和真菌，如何避免标本内细菌或真菌对支原体液体培养结果的干扰，值得进一步研究。