伴视神经炎的多发性硬化患者外周血CD19+B细胞中基因差异表达及相关通路的研究

许 思

多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一种中枢神经系统免疫介导性疾病，以炎症性、脱髓鞘性及神经系统退行性变性为主要特征。中枢神经系统白质及灰质的炎性病变是多发性硬化的主要发病原因，也是中枢神经系统神经细胞损伤的原因[1，2]，其致病原因尚不明确，研究表明多种促炎因子的释放和免疫细胞的激活在多发性硬化的致病过程中起到了重要的作用。目前，多发性硬化的诊断是十分困难的，多发性硬化的经典诊断手段主要依赖于患者病史、临床症状、体格检查以及各种辅助检查如核磁共振、脑脊液和血的实验室检查、电生理学检查等方式的综合判断[3]。现应用于临床诊断多发性硬化的生物学标志物主要有糖蛋白、趋化因子、IgG、IgM抗体以及细胞表面标志物等[4]，但仍缺乏特异性好及敏感性高的生物学指标。多发性硬化疾病表现的复杂性导致了这些生物学标志物与疾病的诊断难以建立良好的关联性以及指导意义。因此，识别多发性硬化患者中的差异表达基因，发现新的特异性标志物，从分子水平挖掘多发性硬化的致病机制，可以为多发性硬化的诊治提供新的方向。

视神经炎是多发性硬化的常见临床表现之一，约有25%的MS患者的主要症状为视神经炎，且约有30%～70%的MS患者可在多发性硬化的整个病程中出现此症状。视神经炎的病理改变包含一个与轴索丢失相关的复杂的髓鞘脱失和再生的过程，尽管疾病的机制与炎性脱髓鞘相关，但其触发成分尚不清楚。多发性硬化的症状多变且不可预测，但许多MS患者由于视神经脱髓鞘而导致视力急剧下降并难以恢复，且对于此种视神经炎缺乏良好的康复方法，使得许多患者遗留下视力的残疾，亦对患者的工作和生活产生了巨大的不便。

近年来，随着基于基因芯片的高通量测序平台的建立使得在癌症、免疫系统疾病、心脑血管疾病等多种领域疾病的分子层面上的相关致病机制研究有了突破性的进展，同时成为筛选疾病发生过程中的重要遗传物质、识别及诊断疾病预后的关键性生物学标志物的一种重要的方法和工具[5]。

本研究通过检索Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中伴视神经炎的多发性硬化相关研究的基因数据集，进一步挖掘相关差异表达的基因，通过GEO、KEGG[6]等在线数据库系统分析多发性硬化患者中差异表达基因的相互作用关系及调控网络，从分子层面深入研究多发性硬化发病的生物学机制，为伴有视神经炎的多发性硬化患者的进一步诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 资料来源 通过NCBI的GEO数据库(https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/)中检索多发性硬化患者基因表达数据，并下载多发性硬化患者的基因芯片表达谱(GSE62584)，该表达谱包括15个外周血CD19+B细胞样本，来自于6个伴有视神经炎的多发性硬化患者以及9个正常人，所取组织为外周血CD19+B细胞，患者的外周血均取自首次发生急性脱髓鞘性视神经炎患者发病的96 h内。

1.2 基因差异表达分析 下载GSE62584后，采用t检验进行差异表达，P值<0.05和差异倍数|logFC|>1为差异表达基因。上述分析采用GEO2R(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/geo2r/)在线分析软件进行，同时使用R包进行数据处理和分析绘图。

1.3 通路富集分析和基因本体分析 通路富集分析和基因本体(Gene Ontology，GO)功能分析通过 DAVID[7](http：//david. abcc. ncifcrf. gov/)数据库中的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集方法和GO功能富集方法进行分析，P值及错误发现率(false discovery rate，FDR)均≤0.5即视为具有统计学意义的生物通路和GO通路。

1.4 蛋白相互作用分析 利用STRING-DB数据库进行蛋白相互作用分析。

2 结 果

2.1 基因差异表达分析 首先，我们将所得到得差异基因表达谱计算数据值分布，并将其可视化，由箱型图我们可以看研究样本经处理后数据均一性良好，两组之间样本具有可比性(见图1)。其次，我们将所有发现的差异基因的数据利用t检验分析出两样本间显著差异表达的基因后，以log2(fold change)为横坐标，以t检验显著性检验P值的负对数-log10(P-value)为纵坐标，实验数据分布情况进行可视化绘图，得到Volcano plot(见图2)。选取差异表达最显著的前50个基因绘制热图(见图3)，可见该基因数据具有显著的差异性。

图1 GSE62584基因数据集箱型图分析(粉色代表多发性硬化患者，蓝色代表正常对照)

图2 GES62584全部基因数据集火山图Volcano plot

图3 GES62584基因数据集热图分析

在GEO2R平台中分别对实验组及对照组数据分组，选取P<0.05及|logFC|>1的基因，去除Gene. symbol为空白的基因，一共有561个差异基因可以纳入标准，其中以logFC均呈现正值标记为上调基因：212个，以logFC均呈现负值标记为下调基因：349个，其中差异最显著的为IL4R，P=0.00000673。

2.2 差异表达基因的通路分析 以“|logFC|>1、P<0.05”为筛选标准，共筛选出561个基因符合标准，将目标基因数据通过基因差异表达分析所筛选出的基因通过 DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/home. jsp)数据库中的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集方法和GO功能富集方法进行分析，发现实验中所鉴定出的差异靶基因主要作用集中在免疫反应、炎症反应、信号传导调控及RNA聚合酶II启动子转录的正调控(见表1)。共有20个差异基因富集于细胞因子与细胞因子受体互作通路中，P<0.05(见图4)，提示细胞因子互作在伴有视神经炎的多发性硬化中起到了重要的作用。

图4 KEGG 通路分析结果

表1 GO生物学过程

2.3 通过 STRING-database 数据库进行蛋白相互作用之间的分析 通过STRING-DB数据库进行靶基因相互作用的分析，共同构成结构复杂的多中心预测差异靶基因的相互作用网络图(见图5)。其中有123条边，节点平均度为2.83，相互作用的差异靶基因主要是：RGS7、PDCL、IL4R、IL4、GNG7等。

图5 蛋白功能性富集结果

3 讨 论

神经系统自身免疫病种类繁多且发病机制复杂，目前的研究发现多发性硬化可能与环境、遗传及免疫等方面有关，由于发病机制尚不明确，诊断筛查较为困难，缺乏特异性的生物标志物和特异性诊断方法[8]。本研究通过基因芯片的方法利用高通量数据，通过生物信息学方法从基因水平进一步的探寻了伴有视神经炎的多发性硬化患者中的关键基因，我们得到了561个显著差异表达的基因，进一步通过DAVID进行GO与KEGG富集分析，深度从分子生物学层面挖掘关基因在疾病中的作用机制。

本研究发现GO富集分析结果显示，这些差异表达的基因主要参与了免疫反应、炎症反应以及细胞信号传导的调控。大量研究表明，免疫细胞、免疫球蛋白参与的免疫调控机制在神经系统自身免疫病的发病中起到了重要的作用，是自身产生细胞免疫的重要机制[9]。伴有视神经炎的多发性硬化患者中异常表达的基因参与的免疫应答及炎症反应，在疾病的致病中发挥了重要的作用。

通过我们的研究同时也发现KEGG信号通路富集在细胞因子与细胞因子受体互作通路(Cytokine-cytokine receptor interaction，hsa04060)。细胞因子是可溶性的细胞外蛋白或糖蛋白，是细胞间调节和动员的关键因子，细胞因子参与先天性和适应性炎症的宿主防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成、发育和修复等过程，目的是维持体内的平衡[10]。因子，细胞因子与细胞因子受体相互作用的通路与自身免疫病中的免疫炎症反应息息相关。伴视神经炎的多发性硬化患者中基因表达异常，存在大量基因表达的上调与下调，也验证了目前的一些研究：固有免疫和适应性免疫应答均参与发病。这类患者可能同时存在免疫功能的亢进和抑制，因此炎症反应的强弱处于不断的变化之中。由此可见，本研究筛选的差异基因及关键通路在伴有视神经炎的多发性硬化患者发病的相关免疫炎症反应扮演了重要的角色，在我们后续的研究中需要进一步验证这些关键基因及通路在疾病中发挥的功能。

多发性硬化相关性视神经炎不同于视神经脊髓炎，多发性硬化相关性视神经炎多为单眼视力下降，可表现为不同程度的视乳头水肿或球后视神经炎，视力损害严重程度不一，一般恢复较好。但视神经脊髓炎相关视神经炎多表现为双眼同时或相继出现的严重的视力损害，视力恢复较查，可检测出视神经脊髓炎相关抗体，如水通道蛋白4抗体(AQP4-Ab)。目前有研究表明BTK/NF-κB信号通路在视神经脊髓炎谱系疾病中可调控B细胞分化，可能参与了疾病的发生[11]。但视神经脊髓炎仍缺乏基因分子层面相关研究，视神经炎作为多发性硬化及视神经脊髓炎的典型症状，基因及分子层面的研究有助于发病机制的阐明，能更好的为两种疾病的鉴别提供依据。

多发性硬化相关性视神经炎不同于视神经脊髓炎，多发性硬化相关性视神经炎多为单眼视力下降，可表现为不同程度的视乳头水肿或球后视神经炎，视力损害严重程度不一，一般恢复较好。但视神经脊髓炎相关视神经炎多表现为双眼同时或相继出现的严重的视力损害，视力恢复较差，可检测出视神经脊髓炎相关抗体，如水通道蛋白4抗体(AQP4-Ab)。目前有研究表明BTK/NF-κB信号通路在视神经脊髓炎谱系疾病中可调控B细胞分化，可能参与了疾病的发生[11]。但视神经脊髓炎仍缺乏基因分子层面相关研究，视神经炎作为多发性硬化及视神经脊髓炎的典型症状，基因及分子层面的研究有助于发病机制的阐明，能更好的为两种疾病的鉴别提供依据。

在最新一版修订版多发性硬化Mcdonald诊断标准中提出，随着MS治疗选择增多，精准诊断显得格外的重要[12]，应结合影像学、血清学、脑脊液及临床特征与病史来探索疾病的诊断。因此，精准识别早期关键的生物学靶点，通过本研究的基因功能和基因参与的通路富集分析，有助于更加深层次的研究疾病的发病机制，同时为快速精准的诊治提供依据。本研究通过生物信息学方法，整合数据库资源，应用国际互联网及计算机等信息技术，将伴有视神经炎的多发性硬化这一复杂且难诊治的疾病的相关基因数据集进行分析研究，使得神经科医师以及科研工作者能够更加深刻的清楚其发病机制，为临床诊治带来了新的希望。