丹参酮ⅡA通过NF-κB通路抑制脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞炎性反应的作用机制

何德全，陈友权，王世祥

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是指以动脉内膜有脂质等血液成分的沉积、平滑肌细胞增生和胶原纤维增多，形成粥糜样含脂坏死病灶和血管壁硬化为主要表现的一种疾病，是心血管疾病的主要病理基础，由动脉粥样硬化导致的心血管疾病已经成为全球死亡的首要原因[1]。目前，越来越多的证据表明，动脉粥样硬化是一种炎症和免疫性疾病。研究显示，血管内皮细胞作为血管壁的重要组成部分，其损伤所导致的异常增殖和凋亡是动脉粥样硬化性疾病发生、发展的共同病理生理基础[2-3]。核转录因子-κB(NF-κB)是一类具有启动基因转录功能的蛋白质，存在于包括心血管细胞在内的多种细胞中，调控细胞的生存、免疫、增殖和凋亡等一系列生理病理过程[4]。NF-κB的活化对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放起决定性作用。持续激活的NF-κB通过促进TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子的表达促发一系列免疫炎性反应，导致细胞损伤。因此，适当抑制NF-κB的活化对心肌重构有积极治疗作用[5]。丹参酮ⅡA是丹参的脂溶性有效单体，具有抗氧化、抑制血小板聚集和抗凝血、抑制平滑肌细胞的增殖、扩张冠状动脉及抗炎的作用，是一种天然的抗动脉粥样硬化药物[6]。Yang等[7]研究表明，在内皮祖母细胞中丹参酮ⅡA可以通过抑制NF-κB活性，下调TNF-α依赖的血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达。因此，丹参酮ⅡA不仅具有抗炎症的作用，还具有潜在的抗动脉粥样硬化作用。本研究拟观察丹参酮ⅡA通过NF-κB通路对脂多糖致人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用，为临床动脉粥样硬化治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参酮ⅡA(纯度98%)购自成都普瑞法公司，HUVECs购自中国科学院上海细胞生物学研究所，脂多糖购自美国Sigma公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁研究所，酶联免疫吸附试验试剂盒购自美国BOSTER公司，RIPA裂解液购自北京索莱宝公司，兔抗VCAM-1单克隆抗体购自英国Serotec公司，TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)p65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和GAPDH单克隆抗体和山羊抗兔(鼠)IgG二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，Triton X-100 购自美国Amresco公司，TRITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PVDF膜购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HUVECs用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，传代时用0.25%胰蛋白酶进行消化，一般2 d换1次培养基，以保证细胞所需的营养成分。

1.2.2 脂多糖浓度筛选 将HUVECs按照2×105个/mL分别接种到96孔板上，每孔200 μL。置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育24 h，至细胞贴壁。弃去上清液，空白组加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，对照组加入培养基，其余各组分别加入不同浓度(0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)的脂多糖培养基，每孔200 μL，每组设置6个复孔。置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中孵育12 h后加入CCK-8，轻轻震荡均匀后放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育30 min，于酶标仪450 nm处测定各孔光密度(OD)值。按照公式计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.2.3 不同浓度丹参酮ⅡA对脂多糖损伤的HUVECs的保护作用 将HUVECs按照2×105个/mL分别接种到96孔板上，每孔200 μL。置于37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中孵育24 h，至细胞贴壁。弃去上清液，空白组加入PBS溶液，对照组加入培养基，脂多糖模型组与用药组分别加入含有脂多糖培养基，每孔200 μL，每组设置6个复孔。置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育12 h之后，弃去上清液，空白组加入PBS溶液，对照组和脂多糖模型组加入完全培养基，其余各组加入不同浓度(0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL)的丹参酮ⅡA，每孔200 μL。置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育6 h后，加入CCK-8，轻轻震荡均匀后放入37 ℃、5%二氧化碳培养箱中孵育30 min，于酶标仪450 nm处测定各孔OD值。按照公式计算细胞存活率。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和白细胞介素-10(IL-10)含量 处理18 h后各组细胞收集于离心管中，1 000 r/min离心5 min，收集上清液，按酶联免疫吸附试验试剂盒操作说明检测上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量。

1.2.5 流式细胞仪检测各组细胞中VCAM-1表达情况 各组细胞处理18 h后，弃去培养基，用PBS清洗两次。用胰蛋白酶消化细胞，加入适量的PBS溶液重悬细胞，1 000 r/min离心5 min。弃上清后，再用含新鲜胎牛血清的缓冲液重悬细胞，成为单细胞悬液，室温下与VCAM-1单克隆抗体避光冰上孵育30 min，再用PBS冲洗细胞，1 000 r/min离心5 min，离心后细胞加入含多聚甲酸的PBS缓冲液中，固定30 min，使用同型对照单克隆抗体确定背景。固定后的单细胞悬液1 000 r/min离心5 min，离心后弃去上清液，用含1%多聚甲醛液重悬细胞，做好每管细胞标记，上机检测。选用流式细胞仪对细胞进行表面抗原检测，并用配套软件进行结果分析。实验独立重复3次。

1.2.6 免疫细胞化学染色法检测各组细胞中VCAM-1表达水平 各组细胞处理18 h后，用PBS洗涤3次；10%甲醛固定30 min，PBS洗涤3次；0.2% TritonX-100作用30 min，PBS洗涤3次，用含10%血清封闭20 min；弃去血清，分别加入稀释后的兔抗VCAM-1单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，加入稀释的TRITC标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h；甘油封片，荧光显微镜观察拍照。

1.2.7 蛋白质印迹法(Western Blot)检测NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 各组细胞处理18 h后用蛋白酶抑制剂裂解液裂解细胞后提取蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，之后加入稀释后的TNF-α、NF-κB、IκBα、GAPDH一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入对应于一抗种属来源的HRP标记的二抗，在室温摇床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析。

2 结 果

2.1 脂多糖诱导HUVECs损伤模型的建立(脂多糖浓度筛选) 在所选定的浓度梯度范围内，脂多糖对HUVECs的增殖有明显抑制作用，且随着浓度上升而抑制率逐渐增加。当脂多糖质量浓度为100 μg/mL时，CCK-8检测到的细胞存活率为47.5%，此时细胞损伤适中(P<0.01)。因此，本实验确定100 μg/mL的脂多糖为诱导HUVECs损伤剂量。详见表1。

表1 脂多糖对HUVECs损伤细胞存活率的影响(±s) 单位：%

2.2 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs的保护作用 脂多糖诱导HUVECs后，脂多糖模型组相对于对照组的吸光度明显降低(P<0.05)，而与脂多糖模型组比较，在0.1～5.0 μg/mL内，不同浓度的丹参酮ⅡA能明显提高损伤后HUVECs细胞活性，具有明显的保护作用，但在10.0 μg/mL时，HUVECs的增殖明显减少，故对损伤后的HUVECs 起保护作用的丹参酮ⅡA浓度应该控制在0.1～5.0 μg/mL。在后续实验中丹参酮ⅡA浓度选择5.0 μg/mL。详见表2。

表2 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs的保护作用(±s) 单位：%

2.3 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs培养液中TNF-α等含量的影响 与对照组比较，脂多糖模型组HUVECs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均增加(P<0.01)，IL-10含量减少(P<0.01)；与脂多糖模型组比较，丹参酮ⅡA组HUVECs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均减少(P<0.05或P<0.01)，IL-10含量增加(P<0.05)。详见表3。

表3 丹参酮ⅡA对TNF-α及IL-1β、IL-6、IL-10含量的影响(±s)

2.4 流式细胞术检测HUVECs中VCAM-1的表达情况 在用脂多糖刺激细胞18 h后，通过流式细胞术分析评估VCAM-1在HUVECs表面上的表达。与对照组比较，脂多糖刺激诱导HUVECs表面上的VCAM-1表达增加(见图1A)。如图1B所示，与对照组相比，用脂多糖刺激18 h增加了平均荧光强度(P<0.001)；丹参酮ⅡA显示出对脂多糖刺激的抑制作用，即平均荧光强度降低(P<0.05)。详见图1。

与对照组比较，＊ P<0.001；与脂多糖模型组比较，# P<0.05。图1 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs中VCAM-1表达的影响(A为VCAM-1的流式图；B为VCAM-1平均荧光强度)

2.5 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs中VCAM-1表达水平 对照组细胞质中有弱VCAM-1蛋白荧光表达，脂多糖模型组细胞质中有强VCAM-1蛋白荧光表达，而丹参酮ⅡA组中VCAM-1荧光表达弱于脂多糖模型组。详见图2。

2.6 丹参酮ⅡA对脂多糖损伤HUVECs中TNF-α、NF-κB p65和IκBα表达的影响 与对照组比较，脂多糖模型组HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表达均上调(P<0.01)，IκBα蛋白表达下调(P<0.01)；与脂多糖模型组比较，丹参酮ⅡA组HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表达均下调(P<0.05)，IκBα蛋白表达上调。详见图3。

与对照组比较，＊ P<0.01；与脂多糖模型组比较，# P<0.05。图3 Western Blot法检测HUVECs中TNF-α、NF-κB p65和IκBα蛋白表达情况(A为蛋白印迹图；B为蛋白表达量)

3 讨 论

动脉粥样硬化与脂代谢紊乱、内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、炎症反应等密切相关[8]，其早期的特征是血管内皮屏障功能和结构改变，影响管腔和管壁之间分子和溶质的运输，导致低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和白细胞更容易在内膜中沉积和浸润[9]。而之后出现的血管内皮损伤则是动脉粥样硬化斑块及再狭窄发生、发展的重要因素。内皮细胞损伤是导致心血管疾病的起始环节和重要指标，其损伤主要由炎症和氧化应激作用两大途径引起[10]。

NF-κB是近年来研究较多的核转录激活因子，可调控细胞因子、免疫分子等多种基因的表达，p65是其最常见的1个亚基[11]。生理情况下NF-κB磷酸化位点被IκB封闭，处于无活性状态。在各种炎性损伤时，上游IKK激酶降解IκB后，使p65迅速转移至核内，p65能识别特定的DNA序列，与某些炎性因子基因启动区或增强子上的κB位点结合，启动相关基因转录，诱导多种细胞因子过量表达，进一步反馈激活NF-κB，从而放大炎症级联反应[12]。在炎症发生中NF-κB可诱导包括炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM-1等在内的多种炎性介质的表达。

丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，其中丹参酮ⅡA是丹参的主要活性成分之一，是丹参脂溶性成分的代表，对于治疗冠心病、心绞痛、心动过速、脑出血均有显著疗效[13]。贾连群等[14]使用脂多糖诱导的HUVECs的EA.hy926炎症反应，使用丹参酮ⅡA对炎症反应下的HUVECs进行刺激，发现TLR4和TNF-α的表达明显受到抑制，并认为抑制TLR4和TNF-α的表达是丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化作用的可能机制之一。

本研究发现，当脂多糖浓度为100 μg/mL时，细胞抑制率为47.5%，因此，确定诱导浓度为100 μg/mL(P<0.01)。在0.1～5.0 μg/mL内，不同浓度的丹参酮ⅡA能明显提高损伤后的HUVECs细胞活性，但在10 μg/mL时，HUVECs的增殖明显减少(P<0.01)，因此，后续试验丹参酮ⅡA浓度选择为5.0 μg/mL。与对照组比较，脂多糖模型组HUVECs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均增加(P<0.01)，IL-10含量减少(P<0.01)；与脂多糖模型组比较，丹参酮ⅡA组HUVECs培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均减少(P<0.05或P<0.01)，IL-10含量增加(P<0.05)，说明丹参酮ⅡA能抑制炎性反应。与对照组比较，脂多糖刺激诱导HUVECs中VCAM-1的表达增加，也增加了平均荧光强度(P<0.001)，丹参酮ⅡA组显示出对脂多糖刺激的抑制作用，即平均荧光强度降低(P<0.05)。对照组细胞质中有弱VCAM-1蛋白荧光表达，脂多糖模型组细胞质中有强VCAM-1蛋白荧光表达，而丹参酮ⅡA组中VCAM-1荧光表达弱于脂多糖模型组，提示丹参酮ⅡA能抑制VCAM-1的表达。与对照组比较，脂多糖模型组HUVECs中TNF-α、NF-κB蛋白表达均上调(P<0.01)，IκBα蛋白表达下调(P<0.01)，与脂多糖模型组比较，丹参酮ⅡA组HUVECs中TNF-α、NF-κB p65蛋白表达均下调(P<0.05)，IκBα蛋白表达上调。

综上所述，丹参酮ⅡA可通过抑制 NF-κB炎症信号途径，抑制炎性因子产生来减轻脂多糖对内皮细胞的损伤。丹参酮ⅡA在动脉粥样硬化防治方面具有进一步研究意义，具体的作用机制还有待体内和体外研究来证明。