心肌STAT3蛋白表达对急性心肌梗死患者病情评估价值研究

王晓杰， 杨 科

北京市和平里医院 急诊内科，北京 100013

急性心肌梗死是冠状动脉在发生闭塞、血流中断的生理基础上，部分心肌因持续性缺血，最终形成的局部坏死。有研究发现，STAT3蛋白作为一种转录激活因子，其本身的蛋白表达对急性心肌梗死的病情具有一定的提示意义，STAT3蛋白亦参与许多与心肌梗死有关信号通路的调控过程[1-4]。本研究旨在探讨心肌STAT3蛋白表达对急性心肌梗死患者病情的评估价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2016年4月至2017年12月北京市和平里医院收治的70例急性心肌梗死患者纳入心梗组，另同期选取77例非急性心肌梗死受试者纳入正常组。两组在性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。急性心肌梗死的判定标准参照2016年欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology，ESC)急性ST段抬高性心肌梗死治疗指南[5]：(1)血清心肌标志物肌钙蛋白升高至少99%参考值上限。(2)冠脉造影证实冠状动脉内血栓形成。(3)符合以下任意一项，病理性Q波形成；心肌缺血症状；明显ST-T改变或新发生的左束支传导阻滞；影像学证据提示有新的心肌活力丧失或新发的室壁运动异常。排除标准：(1)患有心绞痛、急性心包炎、主动脉夹层或急性肺动脉栓塞者。(2)由于直接或间接诱因造成急腹症者。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

表1 两组患者的基线资料比较/例(百分率/%)

1.2 研究方法 通过冠状动脉导管介入抽吸(正常组仅在受试者进入研究队列时，心梗组则在发病时、发病后6、12、24 h分4次进行抽吸)，加H9c2细胞原代培养获取其心肌标本。具体流程：获得的冠状动脉导管介入抽吸的血样中添加1.0×109mmol/L枸橼酸钠抗凝，枸橼酸钠与全血的比例为1∶9，混匀后4℃暂存。将标本以12 000 r/min离心4 min，取上清，超速离心所得微粒加入适量Trizol缓冲液，进行充分裂解，裂解后抽提DNA，并将其转染至H9c2细胞系(购置上海其名生物有限公司)，于37℃、pH 7.2～7.4环境下无菌恒温培养，细胞融合度>90%后进行传代培养，传代次数控制在15～20次。心肌STAT3蛋白表达测定方法[3-5]包括：(1)免疫组化法。常规石蜡经切片、脱蜡、水化后行微波抗原修复，2.5%过氧化氢阻断其内源性过氧化酶，于正常血清中孵育60 min，添加相应的一抗(LAB VISION，购于DAKO公司)，完毕后将所有切片置于湿盒中，4℃过夜。次日取出后，加入二抗系统(Envision KIT)于室温下孵育30 min，PBS溶液冲洗，DAB显色，苏木精复染后脱水，封片。阳性对照由试剂盒提供，阴性对照则用PBS代替一抗系统。(2)免疫印迹法。配置15%分离胶，将凝胶固定于电泳仪上，每个电泳道的上样量20 μg，电泳结束后将凝胶转移至缓冲液中30 min，同时，制取聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，取3～5张滤纸浸入缓冲液中使其浸透，转移结束后取出PVDF膜均匀震荡，4℃过夜，次日弃置封闭液后，加入一抗和二抗于室温下均匀震荡60 min完成孵育过程。孵育过程结束后，室温下TBST溶液对膜进行冲洗，反复3次，每次3～4 min，最后采用bio-rad凝胶成像系统记录最终结果。两组STAT3蛋白表达及免疫组化结果进行对比的过程中，由于STAT3蛋白集中于细胞核中表达，因此通过高倍镜对石蜡切片中的代表性区域(细胞核部位棕黄色深染较密集区域，每个切片选取5个区域)进行检测，按照深染细胞在单位区域内占比数目是否达到20%作为阳性和阴性判定的依据(深染细胞在单位区域内占比数目≤20%判定为阴性，深染细胞在单位区域内占比数目>20%判定为阳性)。

2 结果

2.1 两组STAT3蛋白免疫组化结果比较 正常组STAT3蛋白棕黄色深染率为3.12%，心梗组STAT3蛋白在发病时、发病后6、12、24 h棕黄色深染率分别为36.00%、22.57%、22.00%、15.14%，组间及组内各时间点比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 心梗组STAT3蛋白表达结果(免疫组化×100；a.发病时；b.发病后6 h；c.发病后12 h；d.发病后24 h)

2.2 两组STAT3蛋白Western blot结果比较 两组受试者STAT3蛋白Western blot结果显示，心梗组患者在发病时，发病后6、12、24 h测定蛋白表达量分别与正常组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；心梗阻患者各时间段测得的蛋白表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2～3。

图2 两组STAT3蛋白免疫印迹法检测结果比较

图3 免疫印迹法检测表达量直条图结果比较

3 讨论

有研究发现，心肌梗死患者STAT3表达量可能与G蛋白偶联受体功能发生变化有关[1-2,6-8]。在一般情况下，G蛋白偶联受体通过结合环境中的一些化学物质，引起自身构象的改变，然后再通过胞内结构招募下游因子(如效应蛋白)继而引起多种生物效应，调节生物体的各项生理活动。而与STAT3表达相关的G蛋白偶联受体的下游信号通路有多种，其中主要有两种传导信号：环状腺苷酸途径和磷酸化途径[9]。对于急性心肌梗死患者，STAT3表达量可能是由于G蛋白偶联受体受到心肌梗死特异性标志物激活后发生自身变构，通过串扰开放多条促使细胞凋亡的信号通路，发生胞内结构的改变。STAT3可能是细胞变构招募到的下游因子之一，通过其表达量的改变促进细胞凋亡。

本研究结果显示，心梗组患者在发病时，发病后6、12、24 h测定蛋白表达量分别与正常组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而心梗阻患者各时间段测得的蛋白表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。心梗阻STAT3蛋白表达量高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明，STAT3的表达在细胞完成凋亡程序后无明显的时相性差异。从病理学角度，梗死是一种由于局部血液灌流受阻导致的细胞缺血性坏死，而坏死对于细胞而言是一个程序性过程，坏死的细胞在临终阶段其本身会发生细胞凋亡周期的变化。有研究发现，出现梗死灶的患者，其体内与细胞周期调控相关的信号通路将被动激活，而这些通路的激活会影响到机体内B细胞的动态平衡、细胞因子产生的调节、细胞成分运动的正调控、细胞外刺激反应以及肥大细胞脱颗粒的调节和红细胞分化、多细胞有机体的发育、成纤维细胞增殖的正调节、细胞对氨基酸刺激反应等分子事件的发生[10-11]。其中，B细胞的动态平衡可直接反映人体自身的免疫功能。另外，细胞因子是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，其可通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，从而调控免疫应答。对于急性心肌梗死患者而言，良好的自身免疫功能对疾病预后的改善具有积极意义；而细胞分化在一定程度上可以提示病情恶转的程度，低分化通常提示预后不良。因此，对这些信号通路分析的结果可以早期发现患者的整体病情，并结合患者自身状况制定合理的防治方案。

综上所述，急性心肌梗死患者STAT3蛋白表达量较高，心肌STAT3蛋白对急性心肌梗死有一定的评估作用。