内皮祖细胞来源外泌体在体外循环致脑损伤中作用研究

雷建军， 雷 佳， 周 南， 陈克研， 王 洋

北部战区总医院1.实验动物科；2.神经外科；3.麻醉科，辽宁 沈阳 110016；4.中国医科大学 实验动物部，辽宁 沈阳 110013

体外循环为机械的侵入性循环辅助措施，其产生的脑血管栓塞、痉挛和脑组织的异常灌注可造成原发性脑损伤；各种核转录因子、细胞因子等激活所造成过度的炎性反应又可造成继发性脑损伤[1]。此外，体外循环还可诱导全身性炎症反应和多器官功能障碍[2]。有研究报道，全身性炎症反应显著影响体外循环相关病死率和发病率[3]。辅助性T细胞17(helper T cell 17，Th17)通过分泌细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-17，引起局部组织的炎症性浸润，诱导组织损伤。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)通过表达叉头框蛋白p3(fork head box p3,Foxp3)发挥维护机体免疫平衡的作用。Th17/Treg在正常状态下具有相互拮抗保持机体平衡的作用，二者比例与功能的失衡与脑梗死和各种炎症性疾病的发生、发展密切相关[4]。有研究报道，内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)可分泌大量包含多种生物学功能物质的外泌体，能促进脑创伤后的血管修复[5]。然而，Th17/Treg细胞免疫应答在体外循环致脑损伤中的作用机制尚未明确。本研究通过建立无血预充非停跳体外循环术后认知功能障碍模型，观察来源于EPC的外泌体对体外循环大鼠脑组织炎症性反应和细胞凋亡的影响，并探讨Th17/Treg细胞免疫应答在其中的调控作用，为应用EPC分泌的外泌体治疗体外循环引发的脑损伤提供参考依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 纤维连接蛋白(LONZA，美国)；FITC-MEA-I(Sigma，美国)；DiI-Ac-LDL(Sigma，美国)；胎牛血清(SBI，美国)；ExoQick-TC外泌体试剂盒(SBI，美国)；FITC-CD4、PE-IL-17和BV421-Foxp3(BD，美国)；Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation Perm Diluent(eBioscience，美国)；TUNEL试剂盒(ROCHE，瑞士)；IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、血清酸性钙结合蛋白(serum acidic calcium binding protein，S-100β)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)等酶联免疫吸附检测试剂盒由深圳欣博盛生物科技有限公司提供；CD9、CD63和CD81(Abcame，美国)；B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3，Caspase-3)等单克隆抗体由上海碧云天生物技术有限公司提供；倒置荧光显微镜(FM-500，上海普丹光学仪器有限公司)，酶标仪(Thermo，美国)，荧光显微镜(Olympus，日本)，流式细胞仪(BD，美国)。

1.2 动物分组与模型制备 选取无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠，周龄8～10周，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供。饲养环境温度控制在22℃～25℃，12 h光亮/黑暗条件，自由饮食、饮水。采用随机数字法将SD大鼠分为假手术组、体外循环组与外泌体处理组，每组15只。假手术组大鼠采用气管插管机械通气，仅在右股动脉、右颈内静脉穿刺置管；体外循环组建立无血预充非停跳体外循环术后认知功能障碍模型，建模过程参照文献[6]；外泌体处理组大鼠动物模型同体外循环组，待麻醉苏醒且生命体征稳定后，将其置于固定支架上，无菌状态下尾静脉注射200 μl外泌体悬浮液。

1.3 EPC外泌体培养与提取 EPC培养操作参考文献[7]。采用美国SBI公司不含外泌体的血清配制EGM-2培养基培养EPC，培养48 h后，收集培养基，3 000 r/min离心10 min；吸取培养基上清，加入适量的ExoQuick-TC试剂，充分混匀；4℃过夜，1 500 r/min离心30 min；弃掉上清液，1 500 r/min离心5 min，弃掉上清液；试管底部白色沉淀即为外泌体。采用免疫蛋白印迹法对提取物进行特征性外泌体标记蛋白CD9、CD63和CD81检测。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能学评分 制模后第3、5天采用Garcia神经功能评价标准评估大鼠神经功能状况[8]。

1.4.2 TUNEL染色法检测神经元细胞的凋亡水平 制模后第5天处死大鼠，生理盐水灌流，分离脑组织，常规固定、包埋、切片、脱蜡至水后磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，每次5 min；加入适量破膜工作液，室温孵育25 min，PBS清洗3次，每次5 min；按照2∶29比例加入平衡工作液和TdT的混合液，37℃孵育2.5 h；PBS清洗3次，每次5 min；滴加适量DAPI染液，室温避光孵育15 min；PBS清洗3次，每次5 min；封片剂封片，荧光显微镜下观察并收集图像。设置阴性对照。神经元细胞出现绿色凋亡即为凋亡阳性细胞。

1.4.3 酶联免疫吸附法检测炎症因子及脑损伤标记物表达水平 制模后第5天处死大鼠，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、S-100β、NSE水平。大鼠麻醉，眼球取血，静置后离心获取上清，置于EP管中于-80℃保存待用。向每孔中加入标准品或血清100 μl，充分混匀，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔中加入一抗工作液100 μl；充分混匀，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔加酶标抗体工作液100 μl，充分混匀，37℃孵育120 min，洗板5次；每孔加入底物100 μl，37℃ 避光孵育15 min；加入100 μl终止液混匀；提前30 min预热酶标仪，在450 nm处测吸光值。

1.4.4 免疫蛋白印迹法检测相关蛋白表达水平 制模后第5天处死大鼠，分离脑组织，免疫蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平。取适量海马组织，充分裂解后，12 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清。蛋白质定量法对各组上清样本进行蛋白质定量分析，取等量蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；按照1∶1 000比例配置Bcl-2、Bax、Caspase-3以及GAPDH抗体稀释液，4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，每次5 min。按照1∶5 000比例配置HRP标记的二抗稀释液，室温孵育1 h。采用ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统成像，应用Image J软件计算条带灰度值，将目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行分析。

1.4.5 流式细胞术检测Th17/Treg细胞亚群水平 制模后第5天麻醉大鼠，于无菌超净台内分离脾并研磨，预冷PBS清洗2次；加入红细胞裂解液，4℃孵育5 min，预冷PBS清洗1次，计数细胞数量，设置CD4、IL-17和FOXP3的单标管和阴性对照管；100 μl取106个细胞，加入配置好的离子霉素、Brfeldin A和PMA混合液，CO2温箱中刺激 5 h；预冷PBS清洗2次，加入FITC-CD4抗体稀释液，4℃孵育30 min；预冷PBS清洗1次，加入固定透膜液，4℃孵育50 min；洗液清洗细胞1次，向内加入PE-IL-17和BV421-FOXP3抗体稀释液，4℃孵育30 min；上机检测。

2 结果

2.1 大鼠Garcia 神经功能评分比较 与假手术组比较，体外循环组、外泌体处理组各个时间点大鼠的Garcia 神经功能评分均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与体外循环组比较，外泌体处理组各个时间点大鼠的Garcia 神经功能评分明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠Garcia 神经功能评分评分/分)

2.2 神经元细胞凋亡情况 与假手术组比较，体外循环组、外泌体处理组脑细胞凋亡明显；与体外循环组比较，外泌体处理组凋亡阳性细胞明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 神经元细胞凋亡情况(TUNEL染色×200)

2.3 炎症因子及脑损伤标记物表达水平比较 体外循环组、外泌体处理组中IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明显高于假手术组，IL-10水平明显低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)。外泌体处理组IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明显低于体外循环组，IL-10水平明显高于体外循环组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 炎症因子及脑损伤标记物表达水平

2.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平比较 与假手术比较，体外循环组、外泌体处理组Bcl-2表达水平降低，Bax、Caspase-3表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与体外循环组比较，外泌体处理组Bcl-2表达水平升高，Bax、Caspase-3表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平

2.5 流式细胞术检测Th17/Treg细胞亚群水平结果分析 采用流式细胞术检测脑组织中的Th17(CD4+IL-17+T)、Treg(CD4+FOXP3+T)细胞含量，结果见图3。与假手术组比较，体外循环组、外泌体处理组中的CD4+IL-17+T细胞百分比明显升高，CD4+FOXP3+T细胞百分比明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与体外循环组比较，外泌体处理组中的CD4+IL-17+T细胞百分比明显降低，CD4+FOXP3+T细胞百分比明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 流式细胞术检测Th17/Treg细胞亚群水平

3 讨论

体外循环术是借助特殊的血液处理装置来完成血液循环和氧气运输的一种技术，但其会诱导机体产生多种并发症，其中，脑损伤会使患者出现认知功能障碍，严重影响生活质量。目前，应用药物降低体外循环脑损伤已成为研究的重点。本研究中，外泌体处理组各个时间点大鼠的Garcia 神经功能评分高于体外循环组，凋亡阳性的细胞数量明显少于体外循环组，提示EPC分泌的外泌体能够缓解脑损伤，抑制神经细胞的凋亡。

体外循环期间血液与装置异物的接触、内毒血症、栓塞引起的缺血和再灌注损伤等均可引起内皮细胞损伤，进而激活单核细胞释放炎症因子，引起全身性炎症反应综合征[9-10]。此外，体外循环引起脑损伤后，血脑屏障通透性增加，存在于神经细胞胞质中的S-100β、NSE可通过血脑屏障进入血液。有研究报道，血浆S-100β、NSE的浓度变化与体外循环后认知障碍具有相关性，二者同时上升有助于确诊体外循环后认知障碍[11]。本研究发现，与假手术组比较，体外循环组、外泌体处理组中IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明显升高，IL-10水平明显降低。而外泌体处理组IL-1β、TNF-α、IL-6、S-100β及NSE水平均明显低于体外循环组，IL-10水平明显高于体外循环组，说明EPC来源的外泌体能够降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、S-100β、NSE的含量，促进IL-10的表达，提示EPC来源的外泌体能够抑制炎症反应的发生。

神经细胞凋亡和坏死是体外循环后脑损伤发生的主要原因。Bcl-2基因家族及相关蛋白质在神经细胞凋亡的调控中发挥重要作用[12]。尤其是Caspase-3/Bax/Bcl-2信号通路。Caspase-3活化的作用是进一步促进凋亡的发生、发展，而Bax则为促凋亡的蛋白，Bcl-2是抑制凋亡的蛋白。当细胞凋亡时，Bax表达量会增多，促进线粒体通透性增加，激活Caspase-3蛋白酶，促进细胞凋亡。本研究发现，外泌体干预后显著下调体外循环脑损伤大鼠脑组织中Bax、Caspase-3表达，上调Bcl-2表达，说明EPC来源的外泌体促能够缓解体外循环后脑损伤，其作用机制可能通过调控Bcl-2/Bax通路抑制脑细胞凋亡来实现。

细胞免疫应答在体外循环引发的脑损伤中发挥重要作用。Th17除能分泌IL-17、IL-21和IL-23外，还能分泌IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α等促炎性细胞因子，而IL-17又能进一步促进IL-1、IL-6和 TNF-α等炎症因子、趋化因子、补体的基因转录；促进单核巨噬细胞和中性粒细胞在炎症局部的聚集活化，诱导炎症反应的发生[13]。在IL-21和IL-23的作用下，Treg可转变为炎症性T细胞，加重炎症反应[14]。Th17细胞分泌的IL-17能够促进核因子κB的活化，诱导神经细胞产生抑癌基因、死亡因子配体等促凋亡因子，经过级联反应，激活蛋白酶Caspase导致神经元凋亡[15]。研究表明，阻断IL-17能够调节Bax/Bcl-2介导的线粒体细胞凋亡通路，抑制肺内细胞凋亡[16]。本研究发现，外泌体处理组Th17(CD4+IL-17+T)细胞百分比明显低于体外循环组，Treg(CD4+FOXP3+T)细胞百分比明显高于体外循环组，提示EPC来源的外泌体发挥保护作用与调节Th17/Treg的平衡有关。

综上所述，EPC来源的外泌体能通过调节Th17/Treg细胞的动态平衡，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌和Caspase-3/Bax/Bcl-2信号通路的活化，进而改善体外循环后脑损伤。本研究为防治体外循环脑损伤提供了新的研究思路，但具体相关机制仍需进一步探讨。