超高效液相色谱–串联质谱法同时测定蔬菜中阿维菌素和氟吡菌酰胺的残留

陈丽霞 许丽建 陈歆 彭黎旭

摘  要：为建立同时测定蔬菜中阿维菌素和氟吡菌酰胺残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，采用乙腈高速匀浆提取蔬菜样品中的阿维菌素和氟吡菌酰胺，利用无水硫酸镁和PSA吸附剂进行净化，在UPLC-MS/MS的正离子电离和多反应离子监测模式下进行测定。结果表明，阿维菌素和氟吡菌酰胺的检出限分别为1.0、0.2 ?g/kg;在0.005～0.200 mg/L浓度范围内，其线性相关系数均大于0.999。阿维菌素和氟吡菌酰胺在3个试验水平（0.01、0.02和1.0 mg/kg）的添加回收率分别为83%～106%和90%～108%，相对标准偏差分别在0.5%～5.2%和1.2%～8.4%。本方法前处理过程快速简单，仪器分析灵敏度好，方法准确度高，可用于蔬菜样品中阿维菌素和氟吡菌酰胺农药残留量的检测分析。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱;蔬菜;阿维菌素;氟吡菌酰胺;残留

中图分类号：S481.8      文献标识码：A

Abstract： To determine the residues of abamectin and fluopyram in vegetable samples， a method was established using the ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The vegetable samples were extracted with acetonitrile and purified with MgSO4 and PSA adsorbents. The target compounds were separated by a C18 UPLC column， then detected by electro-spray ionization （ESI+） and multiple reaction monitoring （MRM） mode. Quantification was performed by peak area external standard methods using matrix-matched calibration curves. In the range of 0.005 to 0.200 mg/L with good linear relationships， the correlation coefficients were better than 0.999. The limit of detection （LOD） of abamectin and fluopyram was 1.0 and 0.2 ?g/kg， respectively. At 0.01 to 1.0 mg/kg spiked levels for vegetable samples， the recovery of abamectin was between 83% and 106%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 0.5% to 5.2%; the recovery of fluopyram was between 90% and 108%， and the relative standard deviation （RSD） was in range of 1.2% to 8.4%. This method is simple， quick， accurate， and could be applied to the determination of the four pesticides residues in vegetable samples.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; vegetable; abamectin; fluopyram; residue

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.034

阿維菌素（abamectin）是一种大环内酯类广谱杀菌剂，主要从链霉菌的发酵产物中分离得到，对昆虫和螨类具有较好的触杀和胃毒作用，在农业生产中使用较广[1-3]。氟吡菌酰胺（fluopyram）是一种新型的吡啶基乙基苯甲酰胺类杀线虫剂，可抑制琥珀酸脱氢酶活性，并阻断电子传递，实现防治病原菌或抑制其生长[4-6]。将阿维菌素和氟吡菌酰胺混合使用，可产生一定的协同作用，近年来被广泛的用于各种蔬菜根结线虫的防治[7-8]。由于阿维菌素为非内吸性农药而氟吡菌酰胺为内吸性农药，二者在灌根施用后在作物中的残留量极低，迫切需要发展一种快速、灵敏、同时测定2种农药残留的分析方法。

目前，阿维菌素的残留检测方法多使用高效液相色谱-紫外/荧光检测法[9-10]、高效液相色谱-质谱联用法[11-13]及酶联免疫法[14]等;氟吡菌酰胺的分析方法主要采用传统的抗体免疫法[15]、气相色谱法以及气相色谱-质谱联用法[16-17]，采用液相色谱-质谱联用的检测方法报道较少。有关同时测定农产品中阿维菌素和氟吡菌酰胺残留的方法尚未见报道。本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜样品中阿维菌素和氟吡菌酰胺的残留量，为开展2种杀虫剂的市场监测、保障蔬菜产品质量安全提供技术支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜等样品均购自海口本地市场。

阿维菌素（B1a）标准品（1000 ?g/mL），天津农业部环境质量监督检验测试中心;氟吡菌酰胺标准品（纯度>99%），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇均为色谱纯，美国Fisher Scientific公司;氯化钠和无水硫酸镁均为分析纯，广州化学试剂厂;PSA吸附剂（乙二胺-N-丙基硅烷）为分析純，安谱仪器（上海）有限公司。水为超纯水。

1.1.2  仪器与设备  Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪，美国Waters公司;AB 4500三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司;PL303电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司;ULTRA-TURRAX T25 digital高速匀浆机，德国IKA公司;GL-10C高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2  方法

1.2.1  样品的提取  采用改进的QuEChERS方法[18]对蔬菜样品中的阿维菌素和氟吡菌酰胺进行提取。首先准确称取蔬菜样品（10.0±0.1）g，置于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈溶剂进行提取，在15000 r/min转速下高速匀浆1 min，使样品中目标物被充分提取;加入氯化钠2～3 g，继续在15000 r/min转速下高速匀浆1 min，通过盐析作用去除样品中的蛋白质等杂质;将离心管在4000 r/min转速下离心5 min，使液体和固体相完全分离，同时使有机相与水相分层，取上层乙腈相溶液待净化。

1.2.2  样品的净化   在10 mL离心管中预先加入100 mg的无水硫酸镁和100 mg的PSA吸附剂，准确吸取5.0 mL乙腈相溶液，加入离心管剧烈振荡2 min，以4000 r/min的转速离心5 min，取上清液2.0 mL，过0.22 μm有机相微膜，待仪器分析。

1.2.3  仪器分析条件  色谱条件：选择ACQUITY UPLC?BEH C18液相色谱柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）对样品进行分离，设置柱温为35 ℃。流动相为乙腈（A）和0.05%乙酸铵水溶液（B），流速为0.25 mL/min，以梯度洗脱模式对目标物进行洗脱，并通过预实验对梯度模式进行优化，确保阿维菌素和氟吡菌酰胺得到良好分离。

质谱条件：选择三重四级杆质谱电喷雾正离子扫描和多反应监测模式，主要的工作条件包括喷雾电压5500 kV、雾化气压力379.225 kPa、毛细管温度600 ℃。同时检测阿维菌素和氟吡菌酰胺，其中阿维菌素的定量和定性离子对分别为m/z 890.5/305.2和890.5/567.2，碰撞能量为37/20 V，去簇电压为82 V;氟吡菌酰胺的定量和定性离子对分别为m/z 397.1/173.0和397.1/208.0，碰撞能量为40/31 V，去簇电压为87 V。

1.2.4  标准溶液的配制及标准曲线的绘制   阿维菌素直接使用1000 ?g/mL的标准储备溶液，氟吡菌酰胺使用甲醇配制1000 ?g/mL标准储备溶液，并分别吸取1 mL的阿维菌素和氟吡菌酰胺储备溶液，使用甲醇稀释准确定容至100 mL，配制得到2种目标物的10 ?g/mL混合标准工作液。在样品测定时，分别使用蔬菜样品的空白提取液逐级稀释配制系列基质标准溶液，浓度分别为0.005、0.02、0.05、0.20、0.50 ?g/mL。以进样标准溶液中目标物的浓度（?g/mL）作为横坐标，以定量离子的峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5  基质效应  为评价不同蔬菜基质对阿维菌素和氟吡菌酰胺定量的基质效应，分别以0.05 ?g/mL的基质标准和纯溶剂标准溶液上机测定，记录测定结果并分析不同蔬菜的绩效效应。使用公式（1）计算样品的基质效应[19]，并对其进行评价。

蔬菜基质效应=蔬菜基质标准溶液响应值/纯溶剂标准溶液响应值×100%             （1）

2  结果与分析

2.1  提取条件的优化

分别测试了100 mg的3种不同吸附剂（弗罗里硅土、C18和PSA）对黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜样品中目标物质的净化能力，结果见图1。结果表明，弗罗里硅土吸附剂对阿维菌素存在较强的吸附，其回收率仅为54%～64%，不能满足分析的需求;PSA和C18粉末对阿维菌素和氟吡菌酰胺均可以取得较好的净化效果，回收率均大于80%，可满足分析的需求。由于PSA粉末成本较低，因此在后续试验中选择PSA粉末进行样品净化。

2.2  质谱条件的优化

采用多反应监测模式进行检测，分别以0.5 ?g/mL的阿维菌素和氟吡菌酰胺标准溶液直接注入电喷雾离子源中，优化其质谱条件。在正离子检测方式下进行一级质谱分析，分别得到阿维菌素和氟吡菌酰胺稳定且丰度高的母离子碎片。对比了阿维菌素分别为加氢、钠和铵的母离子，发现加铵母离子的信号强度比其他2种模式提高了100倍以上，因此选择[M+NH4]+作为阿维菌素的母离子，其m/z为890.5;氟吡菌酰胺的加氢母离子具有良好的灵敏度，选择[M+H]+作为氟吡菌酰胺的母离子，其m/z为397.1。以母离子作为目标碎片，优化质谱的去簇电压，确定阿维菌素和氟吡菌酰胺的去簇电压分别为82.1、87.0 V。分析母离子的二级质谱碎片，得到二级质谱碎片的全谱信息，选择信号强度最高的两个离子分别作为定量和定性离子，并进一步仪器的碰撞电压。方法的具体质谱条件见表1，分别选择阿维菌素和氟吡菌酰胺的信号最强碎片离子m/z 305.2和m/z 173.0作为方法的定量离子。

2.3  色谱条件的优化

质谱检测器具有多通道模式，可以实现分析目标物的良好分离。因此，在色谱条件中重点考虑提高阿维菌素和氟吡菌酰胺的分析灵敏度。考虑到阿维菌素在质谱条件下的母离子为加铵模式，因此在流动相中加入0.05%乙酸铵（V/V），可提高阿维菌素的分析灵敏度5倍左右，同时对于氟吡菌酰胺的分析灵敏度没有显著影响。选择乙腈（A）和0.05%乙酸铵水溶液（B）作为流动相，通过调整梯度洗脱中2种流动相的比例，确保阿维菌素和氟吡菌酰胺的快速流出，同时具有良好的分离度。最终确定的洗脱程序为：0～1.0 min，25% B;1.0～4.5 min，60% A;4.5～ 5.5 min，25% A。在该条件下，阿维菌素和氟吡菌酰胺的保留时间分别为3.50 min和2.84 min左右，可在实现快速检测的同时获得良好的检测效果。其中，蔬菜样品（黄瓜）的典型色谱图见图2。

2.4  基质效应

分别检测了黄瓜、西红柿和茄子这3种不同蔬菜样品基质对阿维菌素和氟吡菌酰胺的基质效应，结果见图3。根据结果，基质效应分别为84%～ 92%和96%～107%，说明基质效应对样品定量存在一定影响。为去除蔬菜样品在阿维菌素和氟吡菌酰胺测定过程中的基质效应，在测定实际样品时，均采用对应样品的空白溶液配制基质标准，并绘制标准曲线对目标物进行定量。

2.5  方法的线性范围和检出限

阿维菌素和氟吡菌酰胺在黄瓜、西红柿和茄子3种蔬菜样品基质标准的线性回归方程和相关系数见表2，方法的检出限（LOD，S/N=10）分别为1.0、0.2 ?g/kg。我国食品质量安全国家标准GB 2763—2019[18]中规定蔬菜样品中阿维菌素最大残留限量值最低为0.01 mg/kg（西葫芦），氟吡菌酰胺的临时最大残留限量值最低为0.01 mg/kg（芦笋），本方法可满足其检测分析的需求。

2.6  回收率与精密度

分别在黄瓜、西红柿和茄子样品中添加0.01、0.02、1.0 mg/kg的阿维菌素和氟吡菌酰胺，每个处理重复5次，按照样品的前处理方法进行提取和净化，根据检测分析结果计算方法的添加回收率与相对标准偏差，结果见表3。我国农业行业标准NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》中规定，添加水平在0.01、0.02、1.0 mg/kg时，回收率应分别在60%～120%、70%～120%和70%～110%，相对标准偏差分别在30%、20%和10%以內[19]。本研究中，在0.01、0.02、1.0 mg/kg 3个浓度水平，阿维菌素和氟吡菌酰胺的添加回收率和相对标准偏差均满足要求。

2.7  实际样品检测

在海口本地市场抽取的黄瓜、西红柿、茄子、辣椒、白萝卜共5种蔬菜样品，每种各40个，利用本方法进行检测，所有样品均配制基质标准进行定量分析。结果表明，所抽取的蔬菜样品均未检出阿维菌素和氟吡菌酰胺。本方法具有良好的灵敏度和的重现性，可用于满足市场样品监测的需求。

3  讨论

3.1  阿维菌素和氟吡菌酰胺质谱碎片的选择

阿维菌素是一种十六元大环内酯化合物生物农药，其分子结构中含有大量的羟基。质谱ESI离子源属于一种软电离源，常规的化学分子在离子源正离子模式下有加氢、加钠和加铵3种模式。由于阿维菌素分子量较大，并且含有大量的羟基，其加钠和加铵的信号大于加氢的信号，因此现有报道通常选择加钠和加铵离子作为检测的母离子[20]。但是钠离子不易挥发，容易对质谱造成污染，因此本研究在流动相中加入乙酸铵，保证了目标物形成稳定的母离子，并进一步激发获得子离子，提高了阿维菌素检测的灵敏度和稳定性。与阿维菌素相比，氟吡菌酰胺分子量相对较小，在ESI离子源正离子模式下加氢峰信号稳定、灵敏，因此选择其加氢峰进行分析。

3.2  阿维菌素和氟吡菌酰胺在质谱中的基质效应

串联质谱在复杂样品的农药残留分析时容易受到基质效应的干扰，对结果产生影响。本研究针对可能使用阿维菌素和氟吡菌酰胺防治根结线虫的作物，如黄瓜、西红柿、茄子，其基质中含杂质较少。同时，本研究建立的方法通过PSA和C18粉末对样品中极性和非极性杂质进行净化，均可以有效降低不同样品中杂质的影响。根据结果，阿维菌素和氟吡菌酰胺的基质效应分别为84%～92%和96%～107%，方法的回收率和RSD均满足检测要求[19]，可很好的满足样品中阿维菌素和氟吡菌酰胺残留量的检测分析要求。

3.3  阿维菌素和氟吡菌酰胺的检测灵敏度

阿维菌素和氟吡菌酰胺混用防治蔬菜根结线虫，近年来在生产中广泛使用，其可能的残留为蔬菜带来潜在的安全风险。其中阿维菌素为非内吸性农药，并且阿维菌素的半衰期较短，在灌根的施药方式下，植株果实不直接接触药剂，因此阿维菌素在蔬菜中残留量极小[21]。氟吡菌酰胺则为内吸传导活性的杀菌剂，因此其在灌根使用后可能在植株果实中残留。我国食品安全国家标准中规定，阿维菌素和氟吡菌酰胺在蔬菜中的最大残留限量最低值均为0.01 mg/kg，因此阿维菌素和氟吡菌酰胺的检测方法需要极高的灵敏度。本研究建立的分析方法中，阿维菌素和氟吡菌酰胺的检出限分别达到1.0、0.2 ?g/kg，可以很好的满足检测的需求。

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责任编辑：崔丽虹