GPNMB与肿瘤靶向治疗

翟小田，苗庆芳

·综述·

GPNMB与肿瘤靶向治疗

翟小田，苗庆芳

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家卫生健康委员会抗生素生物工程重点实验室/肿瘤室

非转移性黑色素瘤糖蛋白 B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，GPNMB）是一种高度糖基化的 I 型跨膜糖蛋白，定位于细胞膜或贮存于内涵体及溶酶体中。膜结合型 GPNMB 可被金属蛋白酶如 ADAM 10 裂解，释放出可溶性形式。该蛋白最初被发现于非转移性黑色素细胞而得名，后来还被发现在其他多种正常组织和癌组织中均有表达[1-2]。因此，GPNMB 又名造血生长因子诱导的神经激肽 1 型（HGFIN）、树突状细胞肝素整合蛋白配体（DC-HIL）以及骨激活素（osteoactivin，OA）[3-7]。相比于正常组织，GPNMB 在癌组织中的表达量更高。其正常生理功能包括抗炎、神经保护、参与黑色素体合成等；而在肿瘤组织中，GPNMB 可促进多种癌细胞的生长增殖以及转移侵袭，并且还可以促进癌组织周边血管生成[4, 8-11]。因此，GPNMB 已成为黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤等多种癌症治疗的潜在靶点，但目前针对该靶点在研药物品种相对较少。本文拟对 GPNMB 的结构、生理及病理功能和相关药物的研发进展进行综述，为以其为靶点的药物研发提供参考和依据。

1 GPNMB 的结构

GPNMB 是一种跨膜糖蛋白，主要由胞外区、跨膜区、胞质尾三部分构成[12-13]（图 1）。GPNMB 的胞外区，主要由整合素识别区（integrin-recognition motif，RGD）、多囊肾病结构域（polycystic kidney disease domain，PKD）、脯氨酸富集重复域（proline-rich repeat domain，PRRD）三种亚结构[14-15]构成。RGD 区能够与整合素受体结合，介导细胞间的粘连[4, 10, 16]。PKD 区的功能目前尚不明确，可能与蛋白间或者蛋白与糖的作用有关。在黑色素细胞和黑色素瘤细胞，PKD 的糖基化会影响 GPNMB 在质膜中的表达[17-18]。胞质尾区现已知的结构有免疫受体酪氨酸激活区（hemi-immunoreceptor tyrosine-based activation motif，hemITAM）和双亮氨酸区（di-leucine motif）。hemITAM 在细胞内 Src 介导的信号通路中有重要作用[19]。双亮氨酸区主要与细胞表面受体的快速内化和溶酶体降解相关[20]。GPNMB 的 ECD 脱落后，成为一个可溶性结构，作为旁分泌信号激活一系列信号通路[21-22]，从而可以调节 GPNMB 发挥很多作用，包括促进细胞与细胞的粘连和迁移、促进组织修复、刺激激酶信号、调节细胞生长和分化等，使得 GPNMB 在不同器官和组织发挥重要作用[4, 22-25]。

2 GPNMB 在正常组织的表达与功能

GPNMB 在脑、皮肤、骨骼等多种组织及免疫细胞表面均有表达并发挥重要作用，下面分别进行阐述。

2.1 脑

GPNMB 对受损的脑组织有神经保护作用。GPNMB 表达于正常脑组织，在中枢系统受损后其表达量增加。在星形胶质细胞中，GPNMB 通过 PI3K 和 MEK/ERK 信号通路在附近的运动神经元诱导生存信号，改进肌萎缩诱导的神经退化；反之，由聚泛素化介导的磷酸化 GPNMB 的降解，最终会引起运动神经的死亡[26]。在肌萎缩相关疾病患者的脑组织中，GPNMB 的过表达对神经丝的建立有重要意义[26-27]。在帕金森病患者的大脑黑质和动物模型中发现，GPNMB 会抑制细胞因子 IL-6 的分泌，降低神经炎症[28]。在多囊性脂膜样骨发育不良并硬化性白质脑病患者的大脑中，表达在小胶质细胞中的 GPNMB可促进对髓磷脂碎片的吞噬，保护受损脑组织[29]。脑组织的损伤会引起神经退化、神经炎症、髓磷脂碎片增加等，而受损后脑组织中 GPNMB 的高表达，可以改进神经退化、降低神经炎症并促进髓磷脂碎片的吞噬，对脑组织损伤修复有重要意义。

胞外区 跨膜区 胞质尾 NH2 COOH 信号肽 整合素 多囊肾病 脯氨酸 免疫受体酪氨酸 双亮氨酸区 识别模块 结构域 富集重复域 激活区

2.2 皮肤

GPNMB 作为黑色素细胞的标志物，参与黑色素体成熟的所有阶段[2, 30]。当把 GPNMB 基因沉默后，削弱了 UVB 介导的早期黑色素体的形成，也证明了其在黑色素体形成中的重要性[31]。组织染色证明 GPNMB 表达于正常皮肤的基底层和色素痣，而在白癜风的皮肤不表达，说明 GPNMB 的缺乏是白癜风皮损的一个特征[1, 32-34]。GPNMB 是黑色素体形成的关键蛋白，而黑色素体对皮肤的功能至关重要。GPNMB 的表达异常不仅与皮肤异色病样淀粉样变、白癜风等皮肤病相关，而且会引起黑色素瘤，所以更多有关 GPNMB 的研究及靶向治疗可以为皮肤相关疾病提供更有效的治疗策略。

2.3 骨骼

在骨组织中，GPNMB 可促进破骨细胞的分化，是重要的造骨因子，其表达缺失对破骨细胞分化以及骨基质的矿化造成不良影响[14, 35-36]。有研究表明，在小鼠骨骼发育中，GPNMB 突变可造成骨质缺失[37]。此外，过表达 GPNMB的小鼠，骨质明显增加，造骨细胞数量和活性也增加[38]。GPNMB 对骨吸收有重要作用，如果通过调控启动子来降低 GPNMB 的表达，则骨吸收增加从而导致骨流失[35, 39]。在破骨细胞中，通过外源添加靶向 GPNMB 的抗体，发现破骨细胞的分化被抑制，而在 GPNMB 的基因被敲除后，其表达降低，破骨细胞的活性被抑制，骨基质的形成能力降低[2, 36, 40]。总之，GPNMB 与破骨细胞的分化和造骨细胞的活性密切相关，也是骨基质形成的重要影响因素。

2.4 免疫系统

GPNMB 参与免疫系统的功能，高表达于多种固有免疫相关的细胞中，包括树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞，还可以识别真菌抗原，增强对皮肤真菌的固有免疫[41-43]。在树突状细胞中，GPNMB 的 RGD 区介导其与间皮细胞的粘连，促进细胞间作用[4]。GPNMB 的 PKD 可以与活化 T 细胞表面的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖 syndecan-4 结合，抑制 T 细胞的活化和增殖[3, 6]。GPNMB 通过与一些细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β、IL-1β 等作用，在受损组织发挥抗炎作用，如在牙周炎、肾炎、大动脉炎、皮肤异色病样淀粉样变及白癜风等疾病中，GPNMB 的表达被抑制会增加疾病的易感性[32, 41, 43-45]。在免疫系统中，GPNMB 表达可抑制炎症作用并同时促进组织的修复。此外，其对 T 细胞活性的抑制在黑色素瘤中也有重要的意义。

3 GPNMB 在不同肿瘤中的表达和功能

3.1 黑色素瘤

在大多数黑色素瘤细胞表面以及患者组织样本中，可检测到 GPNMB 高表达[46]。黑色素瘤是死亡率最高的皮肤癌，而传统抗癌药并没有较好的效果，因此 GPNMB 的研究可为黑色素瘤的靶向治疗提供新的策略[47]。在体内研究中，将黑色素瘤细胞 B16F10 的 GPNMB 基因敲除后，皮下注射到小鼠，然后检测其在肺部扩散情况，发现形成的转移灶与对照组相比明显减小，且小鼠肺部和转移灶的黑色素含量明显减少[48-49]。此外，还发现在敲除 GPNMB 后，T 细胞对黑色素瘤的免疫活性明显提高；同时，高表达 GPNMB 的亚细胞群对 T 细胞有明显的抑制作用，该抑制作用由干扰素 γ（IFNγ）和一氧化氮合酶 2（NOS-2）介导[48-50]。说明 GPNMB 有助于黑色素瘤的生长转移和免疫抑制，是黑色素瘤治疗的新靶点。

3.2 乳腺癌

GPNMB 还高表达在基底型乳腺癌细胞中[51-52]。在乳腺癌发展过程中，GPNMB 对癌细胞的生长和转移有重要作用，其在肿瘤上皮中的表达与乳腺癌患者的不良预后有关。研究表明，GPNMB 通过上调神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）的表达促进 VEGF 信号，从而促进乳腺癌的生长。此外，GPNMB 通过其 RGD 区与纤粘连蛋白受体 α5β1 结合，增强乳腺癌细胞对纤粘连蛋白的黏附，从而促进乳腺癌生长和转移。更细致的研究发现，GPNMB 的 RGD 区和胞质尾区对原发乳腺肿瘤的生长是必需的，而仅有 RGD 区的突变才可削弱肺转移的形成[25]。GPNMB 的 ECD 部分可以在 ADAM-10 的介导下，从癌细胞表面脱落[22]。通过收集 GPNMB 阳性的 BT549 细胞条件培养基，并作为体外培养人肺部微血管内皮细胞的趋化因子，发现收集的培养基诱导内皮细胞的迁移速度增加了 2 倍以上；同时，重组的 ECD 诱导内皮迁移速度增加了 1.5 倍。这证明 GPNMB 脱落的 ECD 可以通过直接促进内皮细胞迁移和血管生成，来提高乳腺癌细胞的增殖和迁移能力[22]。在 Wnt-1 阳性的乳腺癌细胞中，GPNMB 可以通过 PI3K/Akt/mTOR 信号通路和提高 β-catenin 的活性，增强 Wnt-1 对乳腺癌生长的促进作用[53]。除此之外，在 GPNMB 的参与下，乳腺癌的恶性程度明显提高，易向肺、骨、肝等发生转移[22, 54]。

3.3 前列腺癌

前列腺癌是欧美男性中最常见的癌症，在所有男性癌症中死亡率排第二[55]。癌症初期可以用手术治疗和抗雄激素治疗，但是该方案在去势抵抗性前列腺癌中基本无效，因此需要更多前列腺癌靶向性的治疗[56]。在对前列腺癌转移侵袭相关的基因筛选中，发现了 GPNMB 的表达异常[57]。在 GPNMB 高表达的前列腺癌细胞 DU145 和 PC3 中，外源添加神经生长因子（NGF）后，会诱导 NGF 的受体 P75NGFR的再生，而 P75NGFR与癌细胞的降解相关，与此同时，发现 GPNMB 表达水平降低[58-60]。这表明在前列腺癌中 GPNMB 可能通过影响 P75NGFR使癌细胞的降解减少，从而促进了其增殖。进一步研究发现，GPNMB 基因沉默后，在影响癌细胞迁移能力的同时，MMP-2 和 MMP-9 活性明显被抑制，说明 GPNMB 可能通过调节 MMP 家族成员的产生和释放从而促进前列腺癌的侵袭和转移[57]。

3.4 肺癌

GPNMB 在肺癌细胞中高表达。通过检测小细胞肺癌患者的血样发现，GPNMB 与总生存率降低密切相关，可作为小细胞肺癌患者的预后指标[21, 61]。与前面提到的乳腺癌相类似，在肺癌中 GPNMB 也通过脱落的 ECD 来促进癌细胞的生长[62]。在非小细胞肺癌细胞 SK-MES-1 中，GPNMB 的 mRNA 水平较高。ELISA 检测发现有大量的 ECD 分泌到培养基中，而且 GPNMB 的表达水平与脱落的 ECD 呈线性相关，且将其基因敲除后，脱落的 ECD 明显减少。另外，体外的划痕实验表明，高表达 GPNMB 的 SK-MES-1 细胞迁移至损伤区域的速率明显高于 GPNMB 表达水平较低的 calu-6 细胞的迁移速率。同样，在细胞侵袭实验中，野生 SK-MES-1 细胞培养基中补充外源重组 GPNMB，侵袭效率相比未补充前高出约 4 倍。而体内实验证明，GPNMB 可有效地促进肿瘤生长。说明 GPNMB 促进肺癌细胞的生长、侵袭和迁移，所以抑制 GPNMB 的表达和中和脱落的 ECD 可能为肺癌的治疗提供新的思路[62]。

3.5 骨肉瘤

骨肉瘤是在儿童和成人中最常见的骨肿瘤，其恶性程度较高、有高侵袭和转移能力，尽管治疗方法不断发展，但是存活率仍然很低[63-64]。在骨肉瘤中发现 PI3K/Akt/mTOR 信号通路被激活，抑制该通路会减弱骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[65-66]。该信号通路还可以调节下游酪氨酸激酶受体，比如胰岛素样生长因子-1（IGF-1）受体，影响细胞的增殖迁移[67]。在骨肉瘤组织中 GPNMB 的 mRNA 和蛋白水平，相比于正常组织，明显上调。在骨肉瘤细胞MG63 和 U2OS 中，GPNMB 基因被敲除后，细胞增殖和迁移能力明显降低，而且 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR 和 mTOR 蛋白水平明显下调，说明 PI3K/Akt/mTOR 的信号通路也被抑制。然后在培养细胞中外源添加 PI3K/Akt的激活剂 IGF-1，发现上述蛋白的表达水平上调，对 PI3K/Akt/mTOR 信号通路的抑制也降低，该通路被激活，对骨肉瘤细胞增殖和转移能力的影响也相应恢复。所以 GPNMB 可以通过 PI3K/Akt/mTOR 通路调节骨肉瘤细胞的增殖和迁移，这也使其成为骨肉瘤治疗的一个潜在靶点[68]。

3.6 卵巢癌

上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌，死亡率较高[55]。通过免疫组化分析组织样本以及实时定量 PCR 进行活体组织检查，发现相比于正常组织，GPNMB 在浆细胞癌、子宫内膜样癌、亮细胞癌等多种上皮性卵巢癌中均有高表达（包括蛋白水平和 mRNA 水平）。研究 GPNMB 的表达与上皮性卵巢癌的临床特点，发现其表达水平与卵巢癌分期密切相关，而且治疗后肿瘤的残余以及淋巴结的转移都与 GPNMB 存在联系。其中，卵巢癌的分期、肿瘤的残余以及 GPNMB 的表达均可作为卵巢癌独立的预后指标[69]。提示 GPNMB 可能作为卵巢癌诊断和治疗的靶点。

4 以 GPNMB 为靶点的肿瘤治疗药物

4.1 CDX-011

CDX-011 是一种抗体偶联药物，是由高亲和力全人源的抗 GPNMB 单克隆抗体CR011 和细胞毒药物海兔毒素的衍生物一甲基澳瑞他汀 E（monomethyl auristatin E，MMAE）通过缬氨酸-瓜氨酸连接子（valine-citrulline linker，VC）偶联而成。CDX-011 通过与肿瘤细胞表面的 GPNMB 特异性结合，然后被内吞进入细胞到达溶酶体，VC 被蛋白酶水解断裂，MMAE 释放，进而破坏微管、抑制有丝分裂并杀伤细胞[46]。临床前研究发现，在人黑色素瘤细胞 SK-MEL-2 移植模型中，当 CDX-011 剂量为 2 mg/kg 时，可以明显抑制肿瘤生长，当剂量为 4.59 mg/kg 时，可使肿瘤消退[47]。在 6 例 GPNMB 阳性的骨肉瘤移植模型中，CDX-011 给药后，有 3 例出现持续完全的响应，其中 2 例 GPNMB 的 RNA 水平最高；同时，GPNMB 表达水平较低的模型对 CDX-011 的响应很低，说明 CDX-011 的体内响应水平可能和 GPNMB 的表达水平有关[70]。

CDX-011 目前在临床试验 II 期阶段，主要在黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤中开展[71-73]。对于黑色素瘤III 期并且对免疫检查点和特定激酶抑制剂没有响应的患者，CDX-011 每三周注射一次，剂量为 1.9 mg/kg，直到病情有进展或者对 CDX-011 产生耐受，研究结果表明无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期明显延长[71]。晚期或转移性乳腺癌患者在化疗前，先用 CDX-011 治疗，其中有 33% 的患者的 PFS 为 12 周，所有患者的 PFS 的中值为 9.1 周，说明 CDX-011 在乳腺癌患者中响应较好[74]。对于预后较差的复发性或难治性骨肉瘤的患者，每 21 天用剂量为 1.9 mg/kg 的 CDX-011 治疗一次，结果表明他们均对该药有较好的耐受[73]。现阶段靶向 GPNMB 的药物非常有限，目前进入临床阶段的只有 CDX-011，相关的临床研究主要在黑色素瘤、乳腺癌和骨肉瘤中进行。由于 GPNMB 的免疫抑制作用在不同癌种有较大的差异，CDX-011 在其他类型癌症中的临床作用也值得开展研究。

4.2 F6V-PE38

F6V-PE38是由 F6V 的高亲和力单链抗体（scFV）片段和铜绿假单胞菌外毒素 A 两部分组成的免疫毒素[75]。在表达 GPNMB 的胶质瘤和恶性黑色素瘤中，F6V-PE38通过抑制蛋白质合成来抑制肿瘤的生长，半数抑制浓度（IC50）为 0.5 ng/ml，而且对裸鼠的皮下恶性胶质瘤模型有很强的抑制作用[75]。F6V-PE38 的研究停留在临床前阶段，可能是因为重组免疫毒素在体内有较强的免疫原性，因此这类药物在设计时应尽可能降低免疫原性，才能更好地在体内发挥抗肿瘤作用并减少毒副作用。

5 展望

近年来，随着对 GPNMB 的研究进展，人们了解到其既在不同的组织、器官发挥不同的生理功能，又在多种肿瘤中有促进生长、侵袭和转移的作用。但是，有关 GPNMB 还有很多问题需要深入研究。例如，GPNMB 可以与 T 细胞表面的 sydecan-4 结合发挥免疫抑制作用，这种结合是否仅需 GPNMB 的 ECD 部分参与，而被释放后的游离 ECD 又能否发挥这种免疫抑制作用仍不清楚。GPNMB 在癌细胞的免疫抑制作用使其可作为免疫检查点，靶向 GPNMB 的抗体是否能通过对其进行抑制来恢复免疫活性，进而发挥较强的抑癌作用，还需要进一步的研究来证明。GPNMB 虽然高表达在黑色素瘤和乳腺癌中，但其通过免疫抑制促进癌症进展的功能在表达量相对较低的直肠癌、胰腺癌和前列腺癌中更明显，这种表达水平与免疫抑制作用的关联性尚不清楚。

在药物方面，虽然 GPNMB 在多种肿瘤中均有高表达，但以 GPNMB 为靶点的药物，目前进入临床阶段的仅有 CDX-011 一种，这可能与以下两方面因素有关。首先，GPNMB 在多种正常组织均有表达，以其为靶点的药物可能会损伤正常组织和细胞，造成较强的副作用；其次，GPNMB 的 ECD 部分在 ADAM10 的作用下会从肿瘤细胞表面脱落，造成药物与脱落的 ECD 结合，不能进入肿瘤细胞发挥作用。针对以上两种情况，我们在设计以 GPNMB 为靶点的抗体药物时，可根据其在肿瘤组织及正常组织的表达差异，筛选中等亲和活性的抗体，使其仅与 GPNMB 高表达的肿瘤组织结合，从而减少药物对正常组织的损伤。此外，在设计药物的给药方案时，可以先给予部分单独的 GPNMB 抗体中和血液中脱落的 ECD，然后再给予抗体偶联药物杀伤肿瘤细胞，从而避免 ECD 造成的脱靶效应。总之，GPNMB 作为一个抗肿瘤靶点，有优点也有不足，随着人们对其研究的不断深入和相关药物的巧妙设计，相信会有更多以其为靶点的药物进入临床并最终问世。

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程资助项目（2016-I2M-3-013）；北京市自然科学基金（7202133）

苗庆芳，Email：miaoqf@sina.com

2020-09-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.010