金荞麦联合SASP治疗大肠湿热型UC的疗效及其对TLR4/NLRP3信号通路的影响

葛飞,刘丽娜,严晶,康安,朱时林,田祖成,梅莉,代海峰,倪海军

(1.南京中医药大学翰林学院海安附属医院，江苏 南通 226600；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是消化系统常见病，近年在我国发病率呈逐年上升趋势。究其病因，可能与遗传、环境因素、饮食习惯和人体免疫等多因素有关，具体机制尚不明确[1]。近年来的研究表明，溃疡性结肠炎的发生发展与Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)[2]、核转录因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)信号、炎症小体信号通路中核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor3，NLRP3)和效应蛋白半胱天冬酶1(Caspase-1)等的异常激活相关，导致一系列炎症因子的释放[3]。

UC治疗困难、易反复，目前临床上多使用5-氨基水杨酸类药物、免疫抑制剂及糖皮质激素等进行症状的控制，临床实践上仍缺乏特效药。近年来，中医药在UC治疗中的应用越来越普遍，许多中医经典方剂及中药在UC治疗中，发挥着独特的疗效。研究表明，中西医结合治疗UC疗效显著优于单一的中医或西医治疗，能显著改善患者的生活质量，具有较好的发展前景[4]。

UC属于中医学“腹痛”“泄泻”“便血”等范畴相关，大肠湿热证为最常见证型[5]。金荞麦具有清热解毒利湿之功，作为江苏南通的道地中药材，被广泛用于治疗肺炎、细菌性痢疾等。课题组前期研究表明，金荞麦治疗腹泻型肠易激综合征[6]及UC[7]均有一定疗效，其机制可能与调控炎症通路有关，但临床研究报道少见。本研究旨在课题组前期研究基础上，进一步观察金荞麦联合传统西药柳氮磺吡啶(Sulfasalazine，SASP)对UC的临床疗效及治疗前后患者结肠活检组织中相关炎症信号通路的影响，探讨金荞麦协同西药SASP对UC治疗的可能机制。

1 临床资料

1.1 一般资料

按照中华医学会《临床诊疗指南·消化系统疾病分册》[8]的诊断标准选取2015年2月-2016年2月在海安市中医院门诊治疗的72例UC患者，舌脉表现为舌质红苔黄腻，脉滑数。采用随机数字表法将72例患者随机分为2组，各36例。对照组男性20例，女性16例;平均年龄(38.90±8.85)岁；平均病程(1.50±1.45)a;轻度22例，中度14例。治疗组男性19例，女性17例；平均年龄(40.18±9.02)岁;平均病程(1.72±1.33)a;轻度23例，中度13例[8]。2组患者的性别、年龄、病程、疾病类型及病情严重程度等资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。该项目研究开展前经海安市中医院伦理委员会审查同意(海中医伦理〔2015〕001号)。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照中华医学会《临床诊疗指南·消化系统疾病分册》[8]。①临床表现：有反复或持续发作的腹泻、腹痛及黏液脓血便，多数伴里急后重，部分可伴肠外表现，有不同程度的全身症状。②结肠镜检查：可见病变呈连续性、弥漫性分布，黏膜质脆、水肿、充血，可见出血和脓性分泌物附着等，重者可见糜烂或溃疡。镜下结肠袋变浅或消失，慢性UC可见到假息肉和桥状黏膜。钡灌肠亦有铅管征等特征性表现。③黏膜活检或手术标本：可见炎症细胞浸润以单核细胞为主，伴糜烂，严重者可有溃疡,隐窝周围炎和隐窝脓肿：腺体紊乱、萎缩，杯状细胞减少,可见潘氏细胞化生。

1.2.2 中医辨证标准 根据中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会2017年发布的《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见》[9]，其中大肠湿热证的主症表现为腹泻,腹痛,黏液脓血便，里急后重；次症为肛门灼热，身热不扬，口苦口干，小便短赤。舌质红苔黄腻，脉滑数。

诊断需主症2项和次症1项或2项，理化检查和舌脉象等作为参考。

1.3 纳入标准

符合上述西医UC诊断标准，中医辨证为大肠湿热证；慢性复发型或初发型；签订知情同意书；受试前4周内没有服用除本研究方案之外的其他药物。

1.4 剔除标准

伴有直肠癌、中毒性巨结肠、肠穿孔、肠梗阻、心脑血管疾病、肝肾功能不全及智障患者不能配合治疗方案者。

1.5 脱落标准

不能按要求完成临床实验，撤回知情同意书或不能按方案随访复查者。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组：予柳氮磺吡啶肠溶片(SASP，上海福达制药有限公司，0.25 g×60片)，每次1 g，4次/d，餐后服，连服1个月。疗程中患者三餐前同时服用安慰剂药片，颜色大小同金荞麦片，每次5片。患者治疗期间避免使用糖皮质激素及其他类似5-氨基水杨酸制剂等药物，避免干扰实验结果。

治疗组：在与对照组同样服法和疗程应用SASP基础上，餐前加用金荞麦片(南通精华制药厂，90片/盒)，每次5片，每天3次，连服1个月。注意事项同治疗组。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 中医证候评分 参照《2002年中药新药临床研究指导原则》[10]进行中医证候评分，将腹泻、腹痛、便血、腹胀、里急后重等症状按轻重程度分别记为0、1、2、3分，积分越高，症状越重。

2.2.2 改良Mayo评分及临床疗效评价 根据《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》(2018，北京)[11]，改良Mayo评分评估项目包括便血、排便次数、内镜表现、医师总体评估等。临床缓解：无单个评分>1分且评分≤2分；轻度活动：3～5分；中度活动：6～10分；重度活动：11～12分。内镜下黏膜愈合：Mayo评分内镜亚评分的绝对值为0分或1分；内镜应答：Mayo评分相对于基线至少下降1分(内镜亚评分)。

2.2.3 血清中白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平测定 治疗前后分别取患者外周静脉血5 mL，4 ℃下静置30 min，以3 000 r/min离心15 min后取上清液，分装保存于-80 ℃冰箱待用。采用ELISA法检测。人IL-1β(货号：437004)，TNF-α(货号：430204)试剂盒购自美国Biolegend公司，按说明书进行操作。

2.2.4 活检结肠黏膜免疫组化 应用石蜡包埋的活检结肠黏膜切片进行TLR4、NLRP3、Caspase-1和IL-1β(抗体均购自武汉谷歌生物科技有限公司)免疫组化分析。切片被脱蜡后，应用二甲苯和乙醇梯度溶液进行再水化，然后用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)清洗。将组织切片应用稀释度为(1∶50)的上述一抗抗体孵育2 h，PBS洗涤3次后在室温下与生物素化的二抗共同孵育，时间30 min。洗涤后，再将组织切片孵育在辣根过氧化物酶(HRP)生物素复合物底物中,时间30 min。切片根据标准方案通过3,30-二氨基联苯胺(DAB)染色，应用标准方法放置到奥林巴斯显微镜下拍片、观察。

2.3 统计学处理

3 结果

对照组脱落2例。

3.1 2组患者治疗前后中医证候积分情况比较

结果见表1。

表1 2组治疗前后中医证候积分情况比较

3.2 2组患者治疗前后改良Mayo评分情况比较

结果见表2。

3.3 2组患者黏膜愈合情况比较

结果见表3。

3.4 2组患者结肠病理HE染色

我们在治疗组和对照组中分别选择了2～3例患者，在治疗前和治疗后的肠镜检查中，采集了结肠活检组织，进行了HE染色及阅片，结果如图1所示，在治疗组中，患者经金荞麦片与SASP片联合治疗后，其结肠病变情况显著好转。

表2 2组治疗前后改良Mayo评分情况比较

表3 2组黏膜愈合情况比较

图1 2组结肠病理变化(HE,×100)

3.5 2组患者治疗前后血清IL-1β、TNF-α水平比较

结果见表4。

表4 2组治疗前后血清IL-1β、TNF-α水平 比较

3.6 2组患者治疗前后NLRP3相关蛋白及TLR4蛋白变化

我们采用免疫组化法对收集到的结肠活检样品进行免疫组化分析，由于每组纳入的病例数较少，无法进行定量描述。如图2所示，我们通过阅片结果，发现在治疗组中，经金荞麦片与SASP片联合治疗后，TLR4、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达量有所下降。且治疗组治疗后，NLRP3和IL-1β的表达与对照组治疗后相比，下降更为显著。

图2 患者肠黏膜组织中TLR4、NLRP3、Caspase-1和 IL-1β的免疫组化图

3.7 2组不良反应比较

经临床观察，2组发生的不良反应主要由药物引起，经及时对症处理，均未影响治疗及实验进程。其中对照组共发生5例，1例头痛，2例恶心，2例白细胞减少，发生率为14.70%。治疗组发生6例，2例头痛，3例恶心，1例白细胞减少，发生率为16.67%。治疗组不良反应率与对照组无差异(P>0.05)。

4 讨论

UC在西方国家十分常见，在发展中国家发病率相对较低，但近年我国关于UC报道的病例显著增加，可能与饮食及环境等因素变化有关。UC患者表现为腹痛、腹泻及黏液脓血便三大典型症状，部分患者有原发性硬化性胆管炎(PSC)或皮肤红斑等结肠外表现。多数UC患者病程迁延难愈，急性起病较少，长期反复发作有致癌的风险。

随着医学领域的快速发展，近年UC治疗方法较多，但至今尚未有突破性治疗手段。传统的氨基水杨酸、激素等四类药物仍是目前UC治疗的主要药物[12]，疗效并不理想，且有较大的副作用，导致病人依从性不高。近年研发的生物制剂等新药因费用高昂等原因尚未能常规推广[13]。为此，寻求有效、安全的传统中药制剂或中西医联合疗法成为中医消化界研究的热点。从病机而言，UC主要与脾胃受损、运化失健相关，进而日久化热，导致肠道湿浊内生而蕴结，气机受阻最终致肠腑失司。从脏腑角度，肺与大肠相表里，病在肠者，亦可调肺以治之[14]。

金荞麦传统用于肺脓疡等治疗，其功效为清热、利湿、解毒。作者及其课题组一直致力于南通道地药材金荞麦的功效研究，根据前期研究基础，课题组发现金荞麦提取物有抗炎、调节肠道免疫之功效，动物实验表明与其抑制NF-κB/NLRP3炎症通路相关[15]，金荞麦有望研制成为治疗UC的新药。在本实验中，我们发现金荞麦联合SASP治疗UC效果更佳，主要表现在抑制促炎性细胞因子如IL-1β和TNF-α的分泌。由于促炎性细胞因子的分泌与体内TLR4和NLRP3信号通路的激活有关，我们对收集的患者结肠活检样品中，分析了相关蛋白的免疫组化结果，结果表明金荞麦片联合SASP治疗对NLRP3和IL-1β的下调作用更为明显，这可能是金荞麦联合SASP治疗UC效果优于单独应用SASP的原因。

综上所述，金荞麦联合SASP治疗UC明显优于单用西药SASP，为中西医结合治疗UC提供了新途径，其作用机制可能与UC患者体内TLR4/NLRP3炎症信号通路受到抑制有关。结合前期动物实验及临床实践表明，传统中药金荞麦抗炎作用确切，该药经过研发有可能成为UC治疗的有效新药。本实验的不足之处是病理机制研究纳入样本量偏小，观察持续时间偏短等，今后将继续开展多中心、大样本、长期跟踪研究。