甲连盆腔胶囊对盆腔炎性后遗症大鼠子宫病理形态及TLR2、TLR4-NF-κB信号通路的影响

王 磊,刘 娅,杨 静,叶 涛,李 娟,付 桢,黄 旭,林光耀,王永周

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医院，四川 泸州 646000)

盆腔炎性疾病是指宫颈内口以上的女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜所发生的感染性疾病，主要包括子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、盆腔腹膜炎等[1]。盆腔炎性疾病反复发作、迁延不愈，最终发展为盆腔炎性后遗症，是临床上引起月经不调、慢性盆腔痛、异位妊娠、不孕的重要原因。近年来，随着性观念的开放，宫腔操作的增多，盆腔炎性后遗症发病呈现年轻化趋势，患病率逐年攀升，严重影响女性健康[2]。由于盆腔炎性后遗症病变部位深处盆腔，临床表现各异，病原体阳性检出率低，单纯抗感染治疗疗效欠佳[3]，且长期应用抗生素有明显不良反应，促使患者寻求中医药治疗。中医辨证论治，审证求因，循证医学研究证实能有效控制盆腔炎性疾病复发，且不良反应较少[4]。但中药治疗盆腔炎性后遗症的作用机制尚缺乏现代科学依据支撑，限制了中医药的推广应用。研究表明，Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)-核因子kappa B(NF-κB)信号通路的激活与盆腔炎性后遗症的发病密切相关，抑制TLR2/4-NF-κB信号通路的异常激活可调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)等炎症因子的分泌和释放，减轻炎症反应，改善免疫功能及盆腔组织病理改变[5]，这为临床上抗炎治疗取得显著疗效的经方验方进行现代药理研究提供了新思路，成为近年研究热点。甲连盆腔胶囊应用于临床多年，治疗湿热瘀结型盆腔炎性后遗症疗效显著，能调节盆腔炎性后遗症患者血清TNF-α、IL-10水平，改善患者预后[6]。课题组前期实验研究发现甲连盆腔胶囊能降低盆腔炎性后遗症大鼠血清TNF-α、IL-2水平，修复组织病理结构，减轻机体炎症损伤[7]。本研究通过建立盆腔炎性后遗症大鼠模型，拟从TLR2、TLR4-NF-κB信号通路角度探讨甲连盆腔胶囊治疗盆腔炎性后遗症的可能作用机制，为该药的临床应用提供更多科学依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠60只，8周龄，均为未孕雌性，体质量200～220 g，购于成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(川)2015-030。饲养于西南医科大学实验动物中心：自然光照，室内温度21～25 ℃，相对湿度控制在40%～60%，自由饮水饮食。

1.2实验材料

1.2.1实验药物 甲连盆腔胶囊(西南医科大学附属中医医院制剂室，批号：20181023)；妇科千金胶囊(株洲千金药业有限公司，批号：20181139)。

1.2.2实验试剂 TNF-α ELISA试剂盒(货号：ZC-37624，茁彩生产)；TLR2、MyD88抗体(美国Affinity公司，批号分别为DF7002，GB5195)；NFKB P65抗体(武汉SERVICEBIO公司，批号：GB11142)；TLR4抗体(武汉SERVICEB公司，批号：GB11519)；山羊血清(北京中杉金桥生物有限公司，批号：SP-9001)；山羊血清(北京中杉金桥生物有限公司，批号：ZLI-9021)，DAB试剂盒(北京中衫金桥生物有限公司，批号：K135925C)。

1.2.3实验仪器 TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)；酶标仪(Multlskan Mk3，赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.3动物分组、模型制备及干预 实验大鼠65只，适应性喂养1周，每只大鼠称体质量并记录。随机抽取12只大鼠作为空白组，不做处理；随机抽取12只大鼠作为假手术组，仅做开关腹手术。剩余大鼠制备盆腔炎性后遗症模型：造模前12 h禁食不禁水，2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)经腹腔麻醉，待麻醉满意后，仰卧位固定，剃毛刀剔除下腹中央的毛，碘伏消毒皮肤，75%乙醇脱碘后再次碘伏消毒，取下腹正中间切口1 cm左右进入腹腔，暴露子宫，眼科镊夹住子宫分叉处，以防苯酚胶浆经阴道流出体外，用1 mL注射器在靠近子宫分叉处分别向左右两侧子宫朝卵巢方向进针，推注浓度为25%的苯酚凝胶(由液化苯酚4 mL、甘油5 mL、阿拉伯树胶1 g、水10 mL配置而成)0.05 mL，注射完毕，松开眼科镊，逐层关闭腹腔，消毒术区，待麻醉复苏后再常规喂养10 d(自由觅食、自由饮水)。操作过程中2只大鼠因麻醉过量死亡。造模第10天，随机抽取3只造模大鼠进行验证：肉眼观察见子宫肿胀，宫腔积水、积脓；HE染色，光镜下观察见子宫组织结构紊乱，上皮细胞变性、坏死、脱落，有单核细胞和淋巴细胞浸润，提示造模成功。验证造模成功后，将剩余36只造模大鼠随机分为模型组、甲连盆腔胶囊组、妇科千金胶囊组，每组12只。按照大鼠与人等效剂量换算法计算出大鼠给药剂量：妇科千金胶囊组0.25 g/kg，甲连盆腔胶囊组0.75 g/kg。将对应药物溶于生理盐水中配制成浓度为40 mg/mL的混悬液，甲连盆腔胶囊组给予甲连盆腔胶囊混悬液18.75 mL/(kg·d)灌胃，妇科千金胶囊组予以妇科千金胶囊混悬液6.25 mL/(kg·d)灌胃，空白组不予处理，假手术组、模型组均予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃，均每日1次，连续14 d。

1.4取材及标本制备 大鼠末次干预结束后禁食不禁水，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，常规消毒后沿原切口剖开腹腔，暴露腹主动脉，5号采血针取血清5 mL，置于试管中待血清自然凝固，室温3 000 r/min离心15 min，取上清液分装于EP管，-20 ℃保存，用于ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；完整取下子宫，一侧组织用4%多聚甲醛固定，4 ℃保存，用于制作石蜡切片，并进一步进行苏木精-伊红染色以及免疫组化检测。

1.5TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达检测 将石蜡切片脱蜡复水，3%的H2O2室温下孵育10 min后PBS溶液冲洗3次(5 min)；电热锅将0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)加热至沸腾，放入切片维持3 min后断电，冷却10 min，重复1次，冷却后取出切片，PBS轻柔冲洗2次(5 min)，进行抗原修复；滴加山羊血清(PBS稀释)封闭液，室温孵育10 min；滴加一抗，37 ℃下孵育1～2 h，PBS冲洗3次(5 min)；滴加生物素化二抗，37 ℃下孵育30 min；PBS水洗3次(5 min)；DAB显色：DAB显色试剂混匀后滴加到切片上，37 ℃显色，镜下控制显色时间(2 min左右)，蒸馏水充分洗涤；苏木素复染；脱水，透明，固封，镜检。采用数码三目摄像显微摄像系统，选取3个视野分别采集图像，底物为白色，阳性表达呈黄色或棕黄色，阴性细胞呈蓝色。所有IHC图像均用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统检测光密度和面积，计算每张图像的MD，3张图像平均光密度的平均数即为每个样本的MD。

2 结 果

2.1各组大鼠子宫外观情况 空白组及假手术组大鼠双侧子宫对称，形态规则，质地柔韧，宫腔通畅，子宫壁光滑；模型组大鼠子宫明显充血、水肿，质地较硬，形态不规则，子宫扭曲、变形，部分宫腔积液、积脓，部分宫腔萎缩、粘连，部分与周围组织粘连。甲连盆腔胶囊组与妇科千金胶囊组子宫炎症程度明显减轻，子宫外观形态改变及宫腔内积液、积脓情况明显改善。见图1。

图1 各组大鼠子宫外观情况

2.2各组大鼠子宫组织HE染色病理表现 空白组子宫壁组织结构层次清晰，内膜上皮完整，单层柱状上皮排列紧密，固有层内腺体完整，平滑肌纤维排列有序，形态规则，分布均匀，浆膜层结构完整。假手术组子宫组织结构完整，肌纤维排列有序，子宫壁结构正常，间质疏松，上皮少量细胞蜕变，少量淋巴细胞及浆细胞浸润，内膜结构完整。模型组大鼠子宫壁结构层次欠完整，平滑肌纤维排列紊乱，子宫内膜上皮细胞大量变性、坏死、脱落，炎性细胞层状浸润并累及全层，内膜充血水肿，可见坏死的内腺体细胞，部分腺体有囊性化改变。甲连盆腔胶囊组及妇科千金胶囊组子宫内膜上皮轻微增生、增厚，少量淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞浸润，黏膜层组织结构清晰。见图2。

图2 各组大鼠子宫组织HE染色表现(×200)

2.3各组大鼠血清TNF-α水平 空白组、假手术组、模型组、甲连盆腔胶囊组、妇科千金胶囊组血清TNF-α水平分别为(63.63±4.34)pg/mL、(64.86±4.82)pg/mL、(72.99±4.55)pg/mL、(68.05±5.37)pg/mL、(68.13±5.38)pg/mL，模型组血清TNF-α水平明显高于空白组和假手术组(P均<0.05)，甲连盆腔胶囊组、妇科千金胶囊组均明显低于模型组(P均<0.05)，甲连盆腔胶囊组和妇科千金胶囊组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.4各组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较 模型组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显高于空白组和假手术组(P均<0.05)，甲连盆腔胶囊组、妇科千金胶囊组均明显低于模型组(P均<0.05)，甲连盆腔胶囊组和妇科千金胶囊组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及图3～6。

图3 各组大鼠子宫组织中TLR2免疫组化染色表现(×400)

表1 各组大鼠子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较

3 讨 论

Toll样受体(TLRs)广泛表达于各种组织和细胞，是一种与固有免疫密切相关的带胞外域的I型跨膜受体，可对不同病原相关分子模式(PAMPs)及损伤相关分子模式(DAMPs)进行识别，通过不同的信号路径引发固有免疫应答，介导免疫防御反应，参与感染、炎症、自身免疫性以及肿瘤等疾病的发生[8-9]。MyD88是TLRs的主要衔接蛋白，是TLRs家族中除了TLR3的其他Toll样受体传递信号的共同传导途径，MyD88信号传导通路是TLR2和TLR4信号传导的主要通路。TLR受体与配体结合后，二聚化的Toll样受体同源区(TIR)发生变构，募集接头蛋白分子家族。MyD88的C端区域与TIR结合后MyD88的N端死亡结构域(DD)发生变构，募集含有DD作用域的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，使IL-1受体相关激酶(IRAK)发生磷酸化，经过多个因子的转化最终激活NF-κB，NF-κB和MAPK信号级联反应，诱导炎性因子表达，引起多种炎性细胞因子以及抗凋亡分子的释放，引发炎症反应[10-12]。

图4 各组大鼠子宫组织中TLR4免疫组化染色表现(×400)

图6 各组大鼠子宫组织中NF-κB免疫组化染色表现(×400)

盆腔炎性后遗症是由盆腔炎性疾病反复发作、迁延不愈发展而来，主要病理表现为炎性渗出，组织破坏，广泛粘连、增生及斑痕形成，导致盆腔积液，子宫内膜炎，宫腔粘连，输卵管伞端闭锁、积水等组织形态改变，从而引起慢性盆腔痛、痛经、异位妊娠、不孕等临床表现，严重影响女性生活。这与TLR-MyD88-NF-κB信号传导通路的异常激活相关，其中Toll样受体适度表达可抗感染，清除病原体，而过度的免疫应答导致炎性因子过多释放则造成组织损伤，损伤的组织进一步促进炎性细胞因子释放，形成恶性循环，致使炎症迁延难愈，形成慢性炎症[13]。TLR2、TLR4，作为Toll样受体家族中最具代表性的成员，在女性生殖疾病中具有重要的介导作用。当生殖道支原体感染宿主时，其细胞膜表面的脂质相关膜蛋白(LAMPs)可活化宿主组织表面的TLR2，通过MyD88依赖途径，活化NF-κB，上调炎性因子的合成与释放[14]。女性生殖道淋病奈瑟菌感染时，内毒素激活TLR4，分别通过MyD88和TRIF通路激活NF-κB和IRF-3产生TNF-α、IL-17、IL-6等炎性细胞因子，引起炎症反应[15]。

盆腔炎性后遗症在中医学可归属为“妇人腹痛”“癥瘕”“痛经”“带下病”“不孕症”“产后发热”等范畴。经期、产后胞宫胞脉空虚，血室正开或余浊未尽，癖积胞中；或素体虚弱，调护失宜；或房事不节，劳伤过度，以致湿热、湿毒、寒湿等邪气内侵胞宫，蕴积胞脉、胞络，致气血凝滞，瘀血内阻而导致腹痛。此阶段未得到及时、彻底的治愈，湿热毒邪未尽，与气血相搏结，湿、热、瘀胶结于胞宫脉络，病情迁延日久不愈，则冲任受损、带脉失司，而致带下、不孕、异位妊娠等病症。盆腔炎性后遗症病位主要在胞宫胞络，病因多归结于“寒、热、湿、瘀、虚”，常见证型有湿热瘀结型、气滞血瘀型、寒凝血瘀型、气虚血瘀型等。川蜀之地气候湿热，又嗜食辛辣炙煿，致使脾胃运化失职而湿热内蕴，加之现代女性积极投身社会工作，压力增大、生活方式改变以及活动量减少，则机体最易遭受湿热之邪而产生湿热病证，故本病以湿热瘀结证型在川蜀地区尤为多见[16]。

甲连盆腔胶囊是名老中医庄诚教授在银甲丸基础上因地制宜改进而成，由山银花、蒲公英、连翘、紫花地丁、椿皮、鳖甲、蒲黄、桔梗、姜黄等药物组成，具有清热解毒、祛瘀散结的功效。其中山银花、蒲公英、连翘、紫花地丁味苦，性寒，功效清热解毒、消肿散结；椿皮苦寒燥湿；鳖甲咸寒，功专软坚散结；蒲黄性甘平，长于活血化瘀；姜黄辛温，为活血行气止痛要药；桔梗辛散，合蒲公英功善消肿排脓。全方以山银花、连翘、鳖甲、紫花地丁、蒲公英、椿皮等苦寒之品为主，佐以辛温之姜黄以防凉扼之弊，既能清解热毒化湿，又能化瘀行滞止痛，故可用于正气虚损，余邪未尽，湿热之邪与瘀血搏结，内阻胞宫、冲任，阻滞气机而致的盆腔炎性后遗症。现代药理研究发现，连翘能抑制内毒素作用下大鼠淋巴细胞TLR4、NF-κB的表达及IL-6、IL-10的分泌[17]；桔梗根多糖可通过调节TLR4激活巨噬细胞[18]；鳖甲能够抑制p65的表达，从而阻断NF-κB信号通路，减少其下游靶基因TIMP-1和TGF-β1的合成，上调MMP-2和MMP-9的表达，加快细胞外基质的降解[19]；姜黄素可抑制LPS-TLR4激活MyD88-NF-κB，下调炎性介质和细胞因子的过度表达[20]；蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能抑制IκB-α蛋白磷酸化，通过调控NF-κB信号通路，抑制TNF-α和IL-6的分泌和TNF-α、IL-6、iNOS mRNA的表达以及NO的合成[21]。

考虑盆腔炎性后遗症为感染后遗症期，以组织结构慢性炎症性表现为主要病理改变，故本实验采用化学烧灼法建立盆腔炎性后遗症动物模型，从TLR2、TLR4-NF-κB炎症信号通路探讨甲连盆腔胶囊对盆腔炎性后遗症大鼠的治疗作用及机制。实验结果显示，甲连盆腔胶囊组与妇科千金胶囊组大鼠子宫外观情况及子宫组织病理形态较模型组大鼠有明显改善，大鼠子宫炎症明显减轻，且大鼠血清TNF-α水平与子宫组织中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB表达水平均明显低于模型组。提示甲连盆腔胶囊可能通过抑制TLR2、TLR4-MyD88-NF-κB信号传导通路的激活，调节机体免疫，调控炎症因子的分泌和释放，抑制炎症反应，减轻炎症损伤，从而改善组织病理结构改变。甲连盆腔胶囊治疗该病对TLR2、TLR4-MyD88-NF-κB的调控是否具有量效关系，该通路是否还与其他信号通路具有协同作用，有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。