通络类中药提取物对肺炎支原体感染A549细胞干预作用的研究

姜永红，吕佳佳，赵晓阳

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

肺炎支原体(MP)为引起儿童肺炎的常见病原体，因其易产生重症、多系统并发症及抗生素广泛耐药，成为临床治疗的难点。儿童支原体肺炎归属于中医学中“肺炎喘嗽”“咳嗽”“风温”等证的范畴，其中医病机主要为肺络痹阻，因外感温热毒邪入肺络，导致肺气郁闭，血行迟滞、络脉失养，进一步加重热毒、痰湿、血瘀，三者互结阻于络中，络脉长期滞塞不通易导致络脉气血阴阳损伤，形成虚实夹杂之证[1]。针对肺络痹阻的病机，治疗大法在于通络，通络之法包括通络、宣络、清络、透络、补络、和络、活络、搜络等二十余种。虎杖、半枝莲、蝉蜕是上海龙华医院徐氏儿科治疗儿童支原体肺炎的常用通络类中药，收效良好。本实验旨在研究虎杖、半枝莲、蝉蜕及其药对和小复方的提取物体外抗MP的能力，为临床治疗筛选新的治疗药物及研究中药治疗支原体肺炎的作用机制提供更多依据。

1 实验材料和方法

1.1中药 虎杖、半枝莲、蝉蜕中药饮片购于上海康桥中药饮片有限公司(160721)。

1.2菌株及细胞 肺炎支原体国际标准株MPFH(美国ATCC,15531)，A549细胞由龙华医院肿瘤研究所馈赠。

1.3试剂及仪器 支原体肉汤基础CM403、支原体添加剂-G SR0059(BD,255420)，酚红(Sigma,M5655)，FBS(GIBCO,16000-044)，RMPI-1640(Hyclone,SH30809.01B)，青链霉素(Solarbio,P1400-100)，0.25%胰蛋白酶EDTA消化液(Solarbio,T1300-100)，白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子kappa B(NF-κB)ELISA试剂盒(武汉基因美,DRE10038/DRE10291/XY-E10083)，DMSO、甘油、液体石蜡购于上海百图生物有限公司；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器,RE-52AA)，酶标仪(北京普朗新技术公司,DNM-9602)，低温高速离心机(Eppendorf,5810R)，生物安全柜(Heal Force,HF1200A2)，二氧化碳培养箱(Thermo Fisher,Thermo Forma 3111)。

1.4中药提取及制备 水提法：称取单味药饮片各200 g，药对按虎杖∶半枝莲3∶5、虎杖∶蝉蜕3∶2、半枝莲∶蝉蜕5∶2，小复方按虎杖∶半枝莲∶蝉蜕3∶5∶2混合，置于不锈钢锅中，加10倍纯净水浸泡40 min，第1次煎煮1 h后纱布过滤，第2次煎煮30 min后纱布过滤，合并2次的过滤液，将滤液浓缩至浸膏状，于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。醇提法：称取、混合比例方法同水提法，后置于3 L圆底烧瓶中，加6倍95%乙醇回流提取2次，第1次4 h，纱布过滤；第2次2 h，纱布过滤；合并2次的过滤液，将滤液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪调节温度至60 ℃，回收乙醇，将药液倒入蒸发皿中于70 ℃烘箱中烘干，制成粉末。取提取物粉末，加少量DMSO助溶，再加入双蒸水溶解，超声震荡，过滤除菌，配制生药浓度分别为1 g/mL和1.5 g/mL的中药溶液，保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.5菌液培养 将MP菌株接种至肉汤培养基，置于恒温培养箱内培养5～7 d，当菌液颜色由暗红色变成均匀一致的黄色时收获菌液，采用颜色变化单位(CCU)方法测定MP浓度，调整浓度至1×107CCU/mL作为工作菌液。

1.6最小抑菌浓度(MIC)测定 取无菌96孔细胞培养板，于每排第1孔加入150 μL培养基，第2～10孔加入100 μL培养基，第11孔加入100 μL培养基。接着在第1孔加入中药50 μL，从第2孔开始对倍稀释至第9孔，并于第9孔混匀后吸弃100 μL。设置2组稀释浓度，一组为0.98,1.96，3.91，7.81，15.63，31.25，62.50，125，250 mg/mL；另一组为1.46，2.93，5.86，11.72，23.44，46.88，93.75，187.50，375 mg/mL，然后于第1～10孔加入10 μL菌液。第10孔为阳性对照孔(MP生长对照孔)，第11孔为阴性对照孔(MP培养基对照孔)，加入少量液体石蜡后放入培养箱。当阳性对照孔的颜色由红色变为均匀一致的黄色时读取数值，各组加药孔变黄的前一孔浓度为MIC。

1.7细胞毒性试验 常规培养A549细胞，取细胞混悬液，调整细胞浓度至5 000个/孔，加入96孔板100 μL/孔，置于培养箱中培养过夜后吸弃培养基，加入各组不同的药液100 μL，药液终浓度设置为0.98，3.91，15.63，62.50 mg/mL，每个浓度6个复孔。同时设立无细胞组和细胞对照组。

1.8中药提取物对MP感染A549细胞活力的影响筛选体外抑菌试验效果较好的药物进行实验，分为虎杖醇提低、中、高浓度组，半枝莲醇提低、中、高浓度组，虎杖+半枝莲低、中、高浓度组，小复方低、中、高浓度组，细胞培养同前，低、中、高浓度设置为3.91，7.81，15.63 mg/mL，每个浓度6个复孔。同时设立模型组(MP感染处理)、正常组(A549细胞常规培养)，分别于培养12，24，36，48 h采用MTT法检测各组A549细胞活力。

1.9中药提取物对MP感染A549细胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB的影响 细胞分组、培养及药液终浓度设置同1.8，每个浓度6个复孔，培养24后采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、NF-κB水平。

2 结 果

2.1中药提取物对MP的体外抑菌作用 各药物水提物和醇提物对MP均有一定的体外抑制生长作用，其中小复方醇提物的效果最好，其次为虎杖醇提物、半枝莲醇提物、虎杖+半枝莲醇提物、小复方水提物，再次为虎杖水提物、半枝莲水提物、虎杖+半枝莲水提物、虎杖+蝉蜕醇提物、半枝莲+蝉蜕醇提物，再次为虎杖+蝉蜕水提物、半枝莲+蝉蜕水提物，效果最差为蝉蜕水提物和醇提物。见表1。

表1 各中药提取物体外抗MP的MIC值 mg/mL

2.2中药提取物对A549细胞活力的影响 虎杖、半枝莲、蝉蜕的水提物和醇提物对A549细胞活力有影响，单味药、药对和小复方醇提物的IC50值均大于水提物的IC50值，说明醇提物毒性比水提物小。见表2。

表2 各中药提取物对A549细胞的半数抑制浓度 mg/mL

2.3不同培养组A549细胞活力比较 模型组各时间点的细胞活力均明显低于同期正常组(P均<0.05)；培养48 h后，除虎杖醇提低浓度组外，其他药物组的细胞活力均明显高于模型组(P均<0.05)。见表3。

表3 不同培养组各培养时间点A549细胞活力比较

2.4不同培养组A549细胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB水平比较 模型组TNF-α、IL-6、NF-κB水平均明显高于正常组(P均<0.05)；各药物组TNF-α、IL-6、NF-κB水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且呈量效关系。见表4。

表4 不同培养组A549细胞分泌TNF-α、IL-6、NF-κB水平比较

3 讨 论

络病学说是中医学理论的重要组成部分，《内经》最早提出“经络”的概念，奠定了理论基础；后《金匮要略》中论述了络脉病症的病机为络脉瘀阻，并针对内伤杂病详加叙述，为其奠定了临床证治基础；叶天士首次提出“久病入络”和“久痛入络”的学术思想，丰富了络病学说的内涵。络病学说中的络，是指“经络”和“脉络”的统称。经络之络是对经脉支横旁出的分支部分的统称，主管运行经气；脉络之络系指血脉的分支部分，主管运行血液。络脉按照不同功能分气络、血络，二者相伴共载气血运行；按照不同部位分阴络、阳络，浮现于体表者为阳络，十二经之气血通过阳络温煦、濡养、护卫皮肤，深隐于体内者为阴络，成为五脏六腑结构与功能的有机组成部分[2]。徐氏儿科认为，新病多伤阳络、气络，久病多伤阴络、血络。阳络伤者多为轻症；而热毒、痰湿、血瘀等病理产物多入脏腑而伤阴络，为重症。

通络类中药虎杖性味苦、酸，微寒，归肝、胆、肺经，具有祛风利湿、清热解毒、活血通络、止咳化痰功效，现代药理表明其具有抑菌抗炎、抗病毒、扩张血管、调血脂、抗氧化等作用[3-4]。半枝莲性辛、寒，微苦，归肺、肝、肾经，功效清热解毒、化瘀通络、止血、利水消肿，具有抑菌抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节内分泌、增强免疫等多种药理作用[5]。蝉蜕性凉，味甘咸，归肺、肝经，功效散风除热、搜风通络、利咽透疹、明目退翳、祛风止痉，其药理作用有抑菌抗炎、抗惊厥、祛痰平喘、抗过敏等[6-7]。三药配伍，清热解毒、活血化瘀、止咳化痰、祛风通络协同作用，缓解肺络郁痹的状态，阻断病邪由阳络进入脏腑、进入阴络的途径，恢复肺脏正常生理功能。

MP是一种介于细菌和病毒之间最小原核的微生物，革兰染色阴性，无细胞壁。电镜下可见其呈不对称形态，一端向外膨出形成膜突起，并且黏附于固体表面，可以在细胞表面上滑动[8]。目前肺炎支原体肺炎致病的具体机制仍不十分明确，但主要与呼吸道上皮黏附、毒素作用及免疫紊乱有关，其中免疫功能紊乱在其发病过程中发挥重要作用[9]。MP感染宿主后与其免疫系统相互作用，能引起广泛的异常免疫反应，产生的自身抗体会刺激单核巨噬细胞系统释放细胞因子，导致组织损伤。TNF-α和IL-6是公认的介导炎症反应和免疫调节的促炎性细胞因子，与肺炎支原体肺炎的发生、发展及转归关系密切[10]。叶新明等[11]研究发现重症肺炎患儿肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量越高，感染的程度越重，提示炎症因子能够反映重症肺炎支原体肺炎肺部感染的程度，在其病程和预后中起重要作用。NF-κB是重要的诱导性转录因子，为经典的炎症信号通路之一，而肺炎支原体脂质相关膜蛋白(LAMP)可通过激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌大量TNF-α和IL-6，既能促进自身免疫系统清除病原，也能促进炎症的进一步发展，引起组织损伤[12]。NF-κB的激活调控着其下游大量炎症反应基因，引起瀑布式炎症级联反应，进而引起急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征，甚至多脏器功能衰竭[13]。

本实验结果显示，虎杖、半枝莲、蝉蜕及其药对和小复方均有不同程度的体外抑制MP的作用，且醇提物的抑制效果优于水提物，小复方的效果优于单味药和药对，其抑菌效果可能与不同的提取溶剂和提取方法有关，提示中药不同的提取方法对体外抑菌效果有一定影响；另一方面，蝉蜕虽体外抑菌的结果弱于虎杖、半枝莲，但临床上治疗支原体肺炎的疗效可观，推测蝉蜕并非直接作用于病原体，而是通过调节免疫、抑制变态反应等途径减轻炎症反应，缓解临床症状。

特别鸣谢：感谢中国科学院上海巴斯德研究所公共技术服务中心生物安全实验室(BSL-2)提供实验场地；感谢上海中医药大学中药学院协助进行药物提取。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。