TGF⁃β1、Smad7及VEGF在脑胶质瘤中表达及与病理特征、预后的关系

谢云鹏 柳新 刘兵 于淼 呼铁民★

脑胶质瘤（brain gliomas）是最常见的发生于神经外胚层的上皮性原发性颅内肿瘤，早期诊断与治疗对于改善患者预后具有重要的意义［1］。转化生长因子⁃β1（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β 1）可促进肿瘤细胞的恶性转化、增殖、浸润和转移，而Smad⁃7（small mothers against add⁃7）在TGF⁃β1 信号途径的反馈及交叉调控中起关键作用。此外，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有促进血管新生的作用。既往均存在对TGF⁃β1、Smad7、VEGF 在胶质瘤中的表达及其意义的相关研究［2］，本研究通过探讨其在胶质瘤发生发展中的作用及其相互关系，为临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集57 例2017年5月至2019年1月于承德医学院附属医院神经外科行肿瘤切除术的胶质瘤患者的肿瘤组织作为实验组，纳入标准：①经病理检查均确诊为脑胶质瘤［3］；②所有入选患者的胶质瘤均为原发，术前均未接受过放疗和化疗；排除标准：①合并血液疾病者；②存在其他恶性肿瘤者；③合并风湿免疫及结缔组织病变者。据预后情况分为生存组（n=41）及死亡组（n=16）。

同时选取50 例同期于本院行内减压手术的经电子计算机断层扫描等影像学检测证实无任何肿瘤性疾病的脑外伤患者的正常脑组织，作为对照组。实验组与对照组一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准通过，所有家属均签署知情同意书。

1.2 实验方法

主要试剂：鼠抗人TGF⁃61 单克隆抗体、兔抗人Smad7 多克隆抗体及SABC 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人VEGF 单克隆抗体、通用型链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶（streptavidin peroxidase，SP）试剂盒、3，3′一二氨基联苯胺（3，3′⁃diaminobenzidine，DAB）试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。

检查步骤：标本4 μm 连续3 张切片，切片脱蜡水化，抗原修复15 min，3%双氧水室温孵育，再用10%正常山羊血清室温封闭10 min。加一抗工作液4℃过夜，第2 天加二抗室温孵育，再加SP 室温孵育，最后镜下控制DAB 显色，苏木精对比染色，脱水，透明，中性树脂封固，镜下观察，计数评分，拍照。

结果判定标准［4⁃5］：采用Volm 双评分法进行判定，在染色均匀的肿瘤区，选取5 个高倍镜视野（×400）综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果：阴性（-）：0 分，弱阳性（+）：1～2 分，中度阳性（++）：3～4 分，强阳性（+++）：5～6 分，以（-）及（+）作为弱表达，（++）及（+++）作为强表达。

1.3 随访方法

本研究随访从患者术后开始，直至患者死亡或本研究的随访结束；随访方式以来院复查为主（特殊情况采用电话随访）；总生存时间表示患者从手术治疗至死亡的时长［6］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；采用多元Logistic 回归分析影响脑胶质瘤患者预后生存的危险因素，Kaplan⁃Meier 生存曲线分析TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 与患者预后生存的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达情况

实验组TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 高表达率较对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 实验组与对照组TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达比较［n（%）］Table 1 Comparison of TGF⁃β 1，Smad7 and VEGF expression between the two groups［n（%）］

图1 TGF⁃β1、Smad7 和VEGF 在脑胶质瘤组织免疫组化实验图（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemical study of TGF⁃β1，Smad7 and VEGF in gliomas（SP，×400）

表2 TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 与脑胶质瘤患者不同病理参数的关系［n（%）］Table 2 Relationship between TGF⁃β 1，Smad7，VEGF and different pathological parameters in patients with glioma［n（%）］

2.2 TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达与脑胶质瘤不同病理参数的关系

TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达与脑胶质瘤患者组织分化程度、WHO 分级有显著相关性（P＜0.05），见表2。

2.3 生存组与死亡组TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达比较

死亡组TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 高表达率较生存组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 影响脑胶质瘤患者预后生存的单、多因素分析

组织中低分化、WHO 分级：Ⅲ+Ⅳ级和TGF⁃β1、VEGF 高表达及Smad7 高表达是影响脑胶质瘤患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

2.5 TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 与患者预后生存的相关性分析

TGF⁃β1 低表达组、Smad7 低表达组、VEGF 低表达组平均生存时间较高表达组长，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

表3 生存组与死亡组TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达比较［n（%）］Table 3 Comparison of TGF⁃β 1，Smad7 and VEGF expression between survival group and death group［n（%）］

表4 影响脑胶质瘤患者预后生存的单、多因素分析Table 4 Univariate and multivariate analysis of prognosis and survival in patients with glioma

图2 TGF⁃β1、Smad7 及VEGF 表达情况下Keplan⁃meier生存曲线图Figure 2 different TGF⁃β1、smad7 and VEGF expression situation⁃meier survival curves

3 讨论

研究发现，胶质瘤的发生、发展是许多基因及细胞因子共同作用的结果，故开发脑胶质瘤早期诊断的标记物成为目前治疗胶质瘤研究的方向［7］。

TGF⁃β 在调节多种类型细胞的分化、增殖、凋亡、粘附和细胞外基质的合成中发挥重要的作用；同时还具有抗炎、抑制免疫，影响血细胞生成、血管生成、细胞趋化等功能［8］。既往研究显示，肿瘤细胞中TGF⁃β 的过表达可造成免疫机能障碍，使肿瘤细胞逃避机体的免疫排斥；同时还可促进血管内皮细胞增生，有利于肿瘤组织血管形成［9］。Shima D T 等［10］对不同级别膀胱癌的免疫组化分析发现，TGF⁃β1 在不同级别膀胱组织中表达呈上升趋势，这与本研究结果相似，提示其在脑胶质瘤的发生、发展及预后中有着重要的影响。Smad7是TGF⁃β 作用的靶基因之一，临床研究显示，其可通过竞争性抑制R⁃Smad 与转化生长因子受体的结合，阻断R⁃Smad 磷酸化；另外，Smad7 还可通过泛素化作用及促进TGF⁃β 受体的降解，抑制TGF⁃β信号的传递［11］。Jiang 等［12］分别对肝细胞癌及胃癌组织Smad7 的表达情况进行了检测，在两种肿瘤中，Smad7 的表达均增加，这与本研究结果相似，进一步证实Smad7 的过表达是促进肿瘤细胞生长的重要机制。VEGF 是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子，其对内皮细胞的增生有强烈的刺激作用，可增加血管通透性，加速肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移，进而促进肿瘤血管形成［13］。本研究结果显示，在脑胶质瘤患者中VEGF 低表达组平均生存时间长于高表达组，提示VEGF 在肿瘤转移及侵袭力的增加方面发挥着重要作用。

此外，本研究采用多元Logistic 回归分析结果显示，组织中低分化、WHO 分级：Ⅲ+Ⅳ级、TGF⁃β1、VEGF 高表达及Smad7 低表达是影响脑胶质瘤患者预后生存的独立危险因素，提示临床治疗中需加强对合并高危因素患者的干预，以改善患者预后，提高生存时限［14］。

综上，TGF⁃β1、Smad7、VEGF 在脑胶质瘤患者中高表达，可参与脑胶质瘤临床生物学进展，并与患者预后生存关系密切。