辣椒花药培养影响因子初步研究

张红肖，范妍芹，孟雅宁，严立斌,2*

（1.河北省农林科学院经济作物研究所，河北 石家庄 050051；2.河北省蔬菜工程技术研究中心，河北 石家庄 050051）

辣椒（Capsicum annuumL.）为茄科辣椒属植物，由于辣椒自然纯合速度慢，育种周期长，因此可以通过花药培养技术缩短育种年限，从而加快育种进程。影响辣椒花药培养的因素很多且不稳定，比如供试辣椒植株的生长情况、供体植株的基因型以及外源激素类型等，这些因素都会引起花药褐化和愈伤化，导致胚状体愈伤率和诱导率降低，不利于花药培养在育种中的应用。Dolcet等[1]利用改良培养基并应用新的方法，提高了辣椒花药培养的诱导率[2]；然而，辣椒花药培养还存在胚状体诱导率低、再生植株分化率低等一系列的问题，限制了其应用范围[3-4]。大多数研究表明，供体材料基因型、花药的小孢子发育时期、培养基的激素浓度组合、预处理的天数等培养条件都会对胚状体的诱导产生不同的影响[5-8]。因此，本研究主要从培养基中植物激素的浓度、低温预处理及高温热激的方式、活性炭浓度几个方面研究对不同基因型辣椒花药培养的影响，旨在为推进辣椒花药培养技术的实用化提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验时间与地点

2019年2月中旬在温室内播种育苗，4月份定植于河北省农林科学院经济作物研究所大田试验地。

1.2 试验材料

供试材料是由河北省农林科学院经济作物研究所茄果室培育的3个不同基因型辣椒材料，分别为19-1（方灯、红色）、19-2（牛角、黄色）、19-3（方灯、黄色），编号分别为L1、L2、L3。MS基础培养基为来自Phyto Technology公司的产品M519。

1.3 试验方法

1.3.1 试验前的准备

1.3.1.1 花蕾的选择 幼苗定植后30 d，待植株进入花期，对不同基因型辣椒材料进行摘蕾，于每天09：00之前采集瓣萼比为1左右，长度为2～3 mm的花蕾[9]，每个品种每次取5～8株的花蕾混合，以消除单株间差异。将采摘的花蕾放入4 ℃冰箱预处理，备用。

1.3.1.2 花药提取 将经预处理的花蕾在超净工作台进行消毒处理，首先用75%的酒精浸泡30 s，然后加入0.1%的升汞消毒8 min，再加入1～2滴Tweet-20并充分晃动10 min，最后用无菌水冲洗3次，时间分别是1、4、10 min，放置于有无菌滤纸的培养皿中（注意挑选保存良好的花蕾，干瘪和有病虫害的直接舍弃）。用镊子轻轻剥开花蕾，选择个头饱满的、无破损的花药以备接种。

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 不同基因型对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响试验 将采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱预处理2 d，按上述方法消毒后剥出花药接种至培养基（MS+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）。接种后在35 ℃暗培养7 d，然后转接至25 ℃，光照度2 500 lx条件下继续培养，每个处理接种25皿，每皿接种10～15个花药。

1.3.2.2 花蕾低温预处理对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响试验 将采摘的花蕾置于密封袋里并放4 ℃冰箱，分别设置处理0（CK1）、1、2、3、4 d低温预处理，以不经低温处理（0 d）为对照，按上述方法消毒后剥取花药接种于培养基（MS+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）中，培养条件及接种数量同1.3.2.1。

1.3.2.3 激素浓度对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响试验 将采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低温预处理2 d，按上述方法消毒后剥取花药进行接种。在培养基（MS+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L，pH值5.8）中分别添加不同激素组合，设置8个激素组合（表1），培养条件及接种数量同1.3.2.1。

1.3.2.4 高温热激处理对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响试验 将采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低温预处理2 d，按上述方法消毒后剥取花药接种至培养基（MS+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，pH值5.8）中，进行35 ℃高温热激（暗培养）处理，热激处理时间分别设置为0（CK2）、3、5、7 d，培养条件和接种数量同1.2.3.1。

1.3.2.5 活性炭处理对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响试验 将采摘的花蕾置于密封袋里放4 ℃冰箱低温预处理2 d，按上述方法消毒后剥取花药接种至培养基（M S+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L，p H值5.8），培养基中活性炭浓度分别设为0（C K3）、2、3、4 g/L，培养条件和接种数量同1.3.2.1。

1.4 数据统计与分析

5个影响因子试验均于花药接种后1周观察其污染情况，及时去除被污染的培养皿，培养30 d后统计分析各处理花药胚状体数量，每周统计1次，胚状体诱导率＝诱导胚状体总数/接种花药数×100%。

采用SPSS统计软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 基因型对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

表2结果表明，辣椒花药胚状体的诱导与供体植株基因型有密切关系。在3个基因型辣椒品种中，有2个基因型（L1、L3）得到了胚状体，但生长点不太明显，L2基因型未得到胚状体。在得到胚状体的材料中，L3诱导率最高，达21.7%；其次为L1，诱导率为17.4%；L2较难出胚，说明该品种不适于用作花药培养的材料。

2.2 低温预处理对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

由图1可知，低温预处理对3个品种的诱导率具有明显的影响。没有经过低温处理的L1，其胚状体诱导率只有14.6%，而低温处理1 d后，胚状体的诱导率提高7.1个百分点，低温预处理2 d，比低温处理1 d提高8.3个百分点，比对照处理提高了15.4个百分点，随着处理时间的延长，胚状体的诱导率反而出现下降，处理4 d后，胚状体的诱导率略低于对照。L2花药的出胚率较低，其中低温预处理1 d和2 d有胚状体出现，诱导率仅有2.86%和7.14%，0、3、4 d都没有胚状体出现，并且随着处理时间的延长此品种花蕾有所褐化。L3花药在低温环境下处理1、2、3 d，其花药胚状体的诱导率在不断上升，处理3 d的诱导率为26.7%，但在3 d以后诱导率开始下降。总体而言，以4 ℃低温预处理2 d的诱导效果较好。

表1 植物激素梯度设计

表2 不同基因型品种对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

图1 低温预处理对花药胚状体诱导率的影响

2.3 不同浓度激素组合对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

表3结果显示，不同浓度激素组合对辣椒花药培养的影响很大，其中L1、L3辣椒基因型在8种不同激素组合处理中都可以诱导出愈伤组织，且均在P5培养基中诱导效果最好，而在其他培养基上效果略微差些，L2辣椒基因型则在P8培养基中诱导效果最好。L3在P5和P8培养基上胚状体诱导率较高，分别为30.0%和22.2%，L1在P5培养基上胚状体诱导率为22.0%，L2的胚状体诱导效果则不理想；因此，初步推断L3品种适合在P5和P8培养基上培养，L1品种适合在P5培养基上培养。

从表3中还可以看出，不同品种在相同培养基中诱导率也有差异，生长素中以0.8 mg/L NAA效果最好，细胞分裂素中则以0.3 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、1.0 mg/L ZT更有利于胚状体的形成；因此，需要根据不同基因型材料筛选适宜的激素组合。

2.4 高温热激处理对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

表4结果表明，随着热激处理时间的延长，L1胚状体的诱导率有明显提高，在0 d和3 d时，可能花药对高温不太敏感，而5、7 d处理的诱导效果最为显著；L2则在处理0、3 d均不能诱导出胚状体，可能是因为该品种花药初期反应不敏感，不能促使愈伤组织形成胚状体，7 d时胚状体的诱导率可达3.00%；L3则随着处理时间的延长，诱导率不断增加，处理7 d比3 d增加了7.0个百分点。此次试验中，3种辣椒基因型在0 d都未能诱导出胚状体，说明辣椒花药培养过程中需要适当延长热激处理时间，才能有效提高辣椒花药胚状体的诱导率。

表3 不同激素浓度组合对辣椒花药胚状体诱导的影响

表4 高温热激对辣椒花药培养的影响

2.5 活性炭浓度对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

由表5可以看出，L1在添加2 g/L活性炭处理时胚状体诱导率最高，比CK3增加1.3个百分点，与CK3的差异达到极显著水平，3 g/L活性炭处理诱导率比CK3降低了4.0个百分点，4 g/L活性炭处理组比CK3降低了5.3个百分点。同样，L3也在添加2 g/L活性炭处理时胚状体诱导率最高，添加3、4 g/L活性炭反而会降低胚状体诱导率。而添加不同浓度活性炭并未增加L2的胚状体诱导率，反而使之降低，对照组的出胚率高达40.9%，活性炭处理均极显著低于对照。由此可见，添加2 g/L活性炭有利于提高L1、L3基因型花药胚状体诱导率，L2并不适宜添加活性炭。可以看到，活性炭对胚状体诱导率的影响与供试材料基因型有关。

3 结论与讨论

前人研究认为基因型决定出胚率[10-11]。杨博智等[2]研究发现，在相同条件下不同基因型的辣椒花药胚状体诱导率不同，诱导率为0%～2%。本试验中相同培养条件下，不同的辣椒品种出胚率差别很大，如L1和L3的出胚率分别为17.4%、21.7%，而L2没有出现胚状体，基因型之所以对出胚率存在显著影响，可能是因为辣椒花药中存在可操控掌握小孢子发育的基因[12]。

Supena等[13]和Pechan等[14]分别采用4 ℃预处理花蕾，都不同程度提高了胚状体的诱导率。Vaulx等[15]研究表明，辣椒花药接种后先在35 ℃环境下进行2～8 d热激处理可提高胚状体的诱导率。本研究发现，预处理对于刺激花药胚状体发生特别重要，不经过预处理直接培养很难获得胚状体和愈伤组织，4 ℃预处理2 d花蕾诱导效果较好，花药接种后35 ℃高温处理7 d，胚状体诱导率明显提高。

激素的种类和浓度对调控细胞分裂、生长和分化有重要的作用，杨敏丽等[16]研究发现，低浓度的NAA和KT可以促进胚状体的形成。而本试验证实：采用NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+ZT 1.0 mg/L的激素组合可提高花药胚状体诱导率。

表5 活性炭浓度对辣椒花药培养胚状体诱导率的影响

多数学者认为添加活性炭对提高胚状体诱导率是有益的。陈晓等[17]认为添加2.5 g/L的活性炭对于辣椒胚状体的诱导较好，本试验结果表明2 g/L活性炭的诱导效果较好，与前人的研究结果相似，可能是由于使用的活性炭颗粒大小不同，其吸附能力也有所不同；也有可能与不同基因型辣椒品种反应不同有关[18]；另外，本试验活性炭浓度梯度设置或许存在不足，有待进一步试验验证。

到目前为止，虽然辣椒花药培养已经有大量的研究报道[19-20]，但仍然存在胚状体诱导率以及出苗率低、玻璃化和污染率高等问题[21]。所以，今后研究内容应集中在开发新的花药培养方案，继续优化培养条件等，从而提高诱导率，为培育新品种奠定基础。