土荆芥挥发油对谷蠹和米象的熏蒸、触杀与驱避活性

(杨悦玲 余晚霞 李敬丹 李春燕 王 凯 梁 倩

(西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室；西南林业大学林学院，昆明 650224)

谷蠹Rhizoperthadominica(Fabricius)属鞘翅目(Coleoptera)长蠹科(Bostrichidae)谷蠹属(Rhyzopertha)昆虫，是一种世界性分布的蛀蚀性储物害虫，热带和亚热带地区发生最多，尤以华南、华中地区发生最为严重，是我国水稻和小麦等谷物的重要仓储害虫[1]。

米象Sitophilusoryzae(Linnaeus)属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)昆虫，为世界性重要储粮害虫，其寄主范围广、繁殖力强、世代重叠和抗逆性强[2]，对多种谷物及其加工品、豆类、油料、干果、药材均可造成严重危害[3]。

储粮害虫不仅导致储粮数量及质量下降，威胁我国粮食安全，而且储粮害虫的排泄物、尸体导致粮食发热、发霉、产生异味，严重危害消费者的身心健康[4]。目前，防治储粮害虫主要采用杀虫松和甲基嘧啶磷等化学防护剂及磷化氢和溴甲烷等熏蒸剂。在长期单一使用下，储粮害虫对多种类型的农药产生了不同程度的抗性[5]，粮食品质下降，食品安全风险增加[6]。化学防治已无法满足人们对生态环保、绿色高效、安全无污染的需求。植物次生代谢产物是植物与昆虫协同进化过程中为抵御昆虫的植食行为产生的化学物质，作用于昆虫的神经、呼吸、消化、内分泌等多个系统，其结构新颖，靶点多样，不易产生抗药性等优点，是开发安全高效储粮杀虫剂的重要来源[7]。植物挥发油是小分子，容易挥发的脂溶性物质，穿透能力强，可破坏昆虫的体壁结构，溶解角质层，促进活性组分的渗透、吸收[8]，适合在密闭空间内通过熏蒸、触杀及驱避的方式实现对储粮害虫复杂多样的生物活性和良好的杀虫效果。

土荆芥(Dysphaniaambrosioides(Linnaeus) Mosyakin & Clemants)是藜科(Chenopodiaceae)藜属(Chenopodium)植物，一年生或多年生草本，原产热带美洲[9]，现已广泛分布于我国大部分地区，通过释放化感物质影响周围植物的生长发育，威胁入侵地的生物多样性，被列入外来入侵物种名录[10]。对土荆芥的开发利用，是解决土荆芥危害的主要途径之一。近年来的研究发现土荆芥挥发油对储粮害虫巴西豆象(Zabrotessubfasciatus)[11]、绿豆象(Callosobruchuschinensis)[12,13]、菜豆象(Acanthoscelidesobtectus)[12]、谷象(Sitophilusgranarius)[12]、大谷蠹(Prostephanustruncatus)[12]、四纹豆象(Callosobruchusmaculatus)[13,14]和玉米象(Sitophiluszeamais)[15]具有熏蒸活性。对玉米象[15]、大谷蠹(Prostephanustruncatus)[16]、谷斑皮蠹(Trogodermagranarium)[16]、绿豆象[17]和四纹豆象[17]具有触杀活性。对巴西豆象[11]、绿豆象[13]和四纹豆象[13]具有驱避活性。黄九玲等[18]研究发现土荆芥乙醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚粗提物对谷蠹具有明显的触杀活性，乙醇和丙酮提取物具有显著的熏蒸活性。土荆芥挥发油对绿豆象、四纹豆象、大豆象、谷象、玉米象和大谷蠹的杀虫活性要优于叶子粉末的杀虫活性，认为叶子杀虫活性是其所含挥发油所致[12]。目前鲜有土荆芥挥发油对谷蠹和米象的熏蒸、触杀及驱避活性的报道。本研究以谷蠹和米象为靶标，测试土荆芥挥发油的杀虫活性，为入侵植物土荆芥开发为植物源农药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 土荆芥样品

土荆芥地上部分于2019年5月采自云南省昆明市宜良县，经度：103°3′43″，纬度：24°58′27″，海拔：1 742 m，阴干备用。

1.1.2 谷蠹的培养条件

供试谷蠹虫源由河南省南阳市淅川县渠首天然趣味昆虫植物馆提供，根据文献[19]的培养条件进行培养。温度27～29 ℃，相对湿度70%～80%，光照周期L∶D=16 h∶8 h，用小麦饲养，置于养虫室饲养7 d 后，筛去成虫，待新一代成虫羽化大量出现10 d左右，筛出成虫作为试虫。

1.1.3 米象的培养条件

供试米象虫源由西南林业大学生物多样性保护与利用学院昆虫学实验室提供，根据文献[20]的培养条件进行培养。恒温培养箱：温度24～27 ℃，相对湿度55%～65%，光照周期L∶D=16 h∶8 h，用大米饲养，置于养虫室饲养7 d 后，筛去成虫，待新一代成虫羽化大量出现一周左右，筛出成虫，作为试虫。

1.2 方法

1.2.1 挥发油的提取

将新鲜的土荆芥样品剪碎阴干，放入2 000 mL的圆底烧瓶中，加适量水，用挥发油提取器提取，水蒸气蒸馏5 h，得到浅黄色油状物，冷冻干燥，配成不同浓度的溶液，4 ℃保存备用[21]。

1.2.2 熏蒸活性的测定

参照[22,23]的方法测定土荆芥发油对谷蠹和米象的熏蒸活性。通过预试验确定测试浓度范围。用正己烷将土荆芥挥发油稀释成5、2.5、1.25、0.625、0.313 mg/mL 5个不同浓度梯度的溶液备用。将10头供试昆虫放入直径2.5 cm，高5.5 cm，体积25 mL的玻璃瓶中，将直径2.0 cm的滤纸用固体胶粘在瓶盖上，吸取10 μL不同浓度的溶液均匀滴在的滤纸片上，挥发20 s后，迅速拧紧瓶盖密封形成密闭空间。正己烷为阴性对照，每组处理重复5次。处理后置于培养箱培养24 h后分别检查各组试虫死亡头数，利用公式(1)和(2)计算死亡率和校正死亡率。用SPSS统计软件计算致死中浓度LC50(mg/L)。

死亡率=死亡虫数/处理总虫数×100%

(1)

校正死亡率= [(处理组死亡率-对照度死亡率)/(1-对照度死亡率) ]×100%

(2)

1.2.3 触杀活性的测定

参照文献[22,23]微量点滴方法，测定土荆芥挥发油对谷蠹和米象的触杀活性。通过预试验确定测试浓度范围，用正己烷将土荆芥挥发油稀释成5个不同质量浓度梯度的溶液备用。点滴法触杀谷蠹时土荆芥的质量浓度：160、80、40、20、10 mg/mL；触杀米象时土荆芥的质量浓度：112.50、56.25、28.13、14.06、7.03 mg/mL。用移液器取0.50 μL不同质量浓度的溶液滴在谷蠹和米象的前胸背板上，每个质量浓度处理10只试虫，重复5次，处理后转移到直径2.5 cm，高度5.5 cm的玻璃瓶中，放入培养箱培养。正己烷做阴性对照，甲氰菊酯做阳性对照。24 h后分别检查各组试虫死亡情况，用式(1)和式(2)计算死亡率和校正死亡率。用SPSS统计软件计算致死中量LD50(μg/头)。

1.2.4 驱避活性的测定

参照文献[23]的方法测定土荆芥挥发油对谷蠹和米象的驱避活性，略有改动。通过预实验确定测试浓度范围。将土荆芥挥发油用正己烷稀释成12.5、2.5、0.5、0.1、0.02 mg/mL 5个不同质量浓度梯度的溶液备用。将直径9 cm的圆形滤纸对称裁开，用固体胶贴在9 cm培养皿底部。用移液枪取正己烷溶液300 μL均匀滴在其中一半滤纸上，并用铅笔在角上画圈标记，再用移液枪吸取土荆芥挥发油不同浓度的样品溶液300 μL，均匀滴在另一半滤纸上，挥发30 s后，将20头谷蠹和米象分别转入培养皿中央，套上丝袜，外用保鲜膜包住，用橡皮筋扎紧，用针在保鲜膜上扎孔，培养箱培养，使试虫自然分散。正己烷和避蚊胺(DEET：N，N-diethyl-3-methylbenzamide)分别作为阴性对照和阳性对照。每个质量浓度重复5次。分别在接虫2、4 h时观察滤纸上试虫分布情况，用式(3)计算驱避率。

驱避率=[(Nc-Nt)/(Nc+Nt)] ×100%

(3)

式中：Nc为出现在正己烷阴性对照区域的试虫数量；Nt为出现在不同浓度土荆芥溶液区域的试虫数量。

2 结果与分析

2.1 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的熏蒸活性

由表1可以看出，土荆芥挥发油对谷蠹熏蒸活性LC50为1.07 mg/L(1.07 μL/L，土荆芥挥发油的密度为0.998 g/mL)，与其他文献报道的运用类似室内生物测定的挥发油相比，土荆芥挥发油对谷蠹表现出更明显的熏蒸活性。如柠檬(Citruslimon)[25]果实，留兰香(Menthaspicata)[26]叶子，蓝桉(Eucalyptusglobules)[27]叶子，大蒜素(Alliumsativum)[27]，荔枝蝽(Tessartornapapillosa)[28]臭液，小茴香(Foeniculumvulgare)[29]种子，八角茴香(Fructusanisistellati)[29]种子，辣根素I和辣根素II[30]对谷蠹熏蒸活性LC50分别为522.868、7.398、7.208、4.565、6.313、4.02、2.88、2.67、1.95 μL/L。可以看出土荆芥挥发油对谷蠹的熏蒸活性优于现有文献报道的其他植物挥发油。

表1 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的熏蒸活性

土荆芥挥发油对米象的熏蒸活性LC50为0.56 mg/L(0.56 μL/L)。薄荷(Menthaarvensis)[31]叶子、穗花牡荆(Vitexpseudo-negundo)[32]叶子、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)[33]叶子、马缨丹(Lantanacamara)[33]叶子、姜黄(Curcumalonga)[34]叶子、小茴香(Cuminumcyminum)[35]种子，波斯百里香(Thymuspersicus)[36]叶子、莳萝Anethumgraveolens)[35]种子、香菜(Carumcarvi)[35]种子、细叶糙果芹(Carumcopticum)[37]种子、荔枝蝽(Tessartornapapillosa)[28]臭液、小叶薄荷(Menthamicrophylla)[33]叶子对米象的熏蒸活性LC50分别为45.5 μL/L、31.96 μL/L、30.81 μL/L、29.47 μL/L、11.36 mg/L、4.75 mg/L、3.34 μL/L、3.29 mg/L、2.45 mg/L、0.91 μL/L、0.48μL/L、0.21 μL/L。土荆芥挥发油对米象的熏蒸活性优于大多数挥发油的活性，但是不及荔枝蝽臭液和小叶薄荷叶子挥发油的活性。

2.2 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的触杀活性

由表2可以看出，土荆芥挥发油对谷蠹触杀活性LD50为16.09 μg/头，与阳性对照甲氰菊酯相比，土荆芥挥发油未表现出更强的毒性。但与仅有的文献报道，灰毛豆(Tephrosiapurpurea)[38]树皮、种子和叶子的挥发油对谷蠹五龄若虫LD50分别为25.0、27.9、27.8 mg/头相比，土荆芥挥发油对谷蠹的触杀活性优于灰毛豆树皮、种子和叶子挥发油的活性。

表2 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的触杀活性

土荆芥挥发油对米象触杀活性的LD50为9.62 μg/头，与阳性对照甲氰菊酯LD50为12.93 μg /头和文献报道的龙舌兰(Agaveamericana)[20]叶子脂溶性成分烷烃对米象触杀活性LD50为10.55 μg /头相比，土荆芥挥发油表现出更强的触杀毒性。

2.3 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的驱避活性

土荆芥挥发油对谷蠹和米象的驱避活性结果见表3。土荆芥挥发油对谷蠹的驱避活性：在最大浓度为58.975 μg/cm2时，处理2 h，土荆芥挥发油对谷蠹的驱避率为64%，与阳性对照避蚊胺的驱避率66%接近；处理4 h，土荆芥挥发油对谷蠹的驱避率为82%，优于避蚊胺的驱避率66%。土荆芥挥发油对米象的驱避活性：在最大浓度为58.975 μg/cm2时，处理2 h和4 h，对米象的驱避率分别为33%和55%，均优于阳性对照避蚊胺的驱避率13%和18%。从以上数据可以看出，土荆芥挥发油对谷蠹和米象两种仓储害虫具有良好驱避活性。

表3 土荆芥挥发油对谷蠹和米象的驱避活性

3 讨论

挥发油的化学成分是其杀虫活性的物质基础，土荆芥挥发油的化学成分随产地不同而不同。本实验所用土荆芥采自云南省昆明市，挥发油相对含量较高的成分有：(+)-4-蒈烯(36.136%)、2-蒈烯(23.897%)、邻伞花烃(10.992%)、驱蛔素环氧化物(9.047%)、驱蛔素(4.882%)等。喀麦隆西部[12]土荆芥挥发油的主要成分为伞花烃(cymol，50.0%)、α-松油烯(α-terpinen，37.6%)、驱蛔素(ascaridole，3.5%)、香芹酚(carvacrol，3.3%)和cis-β-法呢烯(cis-β-farnesen，1.4%)。印度戈勒克布尔[39]地区土荆芥挥发油的主要成分为驱蛔素(ascaridole，38.03%)、α-松油烯(α-terpinene，37.74%)、对伞花烃(p-cymene，16.7%)、异驱蛔素(isoascaridole，2.55%)和柠檬烯(limonene，1.90%)。化学成分的差异性导致杀虫活性的差异性。土荆芥挥发油成分显著差异的主要原因可能是由于生境、采收时间及采集部位的不同。

土荆芥对储粮害虫不仅具有熏蒸、触杀与驱避活性，还会影响害虫的产卵和发育。Tapondjou等[12]研究发现土荆芥叶子粉末分别与玉米、麦子、豌豆、绿豆和白豆混合，质量浓度从1.6%～6.4%分别作用于玉米象、大谷蠹、谷象、绿豆象、四纹豆象和菜豆象，均显著抑制害虫产卵和成虫羽化。Pandey等[17]研究发现土荆芥挥发油1%和5%的丙酮溶液与木豆种子混合，100%抑制绿豆象和四纹豆象成虫在木豆种子上产卵且没有羽化成虫出现。用10%土荆芥挥发油丙酮溶液进行植物毒性试验，处理过的木豆种子发芽率为75%，与对照组发芽率79%比较无显著差异。处理和未处理的木豆种子储藏6个月后进行感官评价，发现处理过的木豆种子无论从外观色泽、风味、口感等方面均优于未经处理的木豆种子，更受消费者的欢迎。

挥发油中含有的单萜类化合物，使其具有杀虫活性、熏蒸活性、抑制昆虫产卵及抑制昆虫生长发育的主要原因[17]。Pollack等[40]研究发现驱蛔素是土荆芥挥发油杀疟原虫的活性成分。Chu等[15]研究了产自福建省土荆芥挥发油中含量最高的三种化合物驱蛔素[(Z)-ascaridole，29.7%]，异驱蛔素(isoascaridole，13.0%)和对伞花烃(ρ-cymene，12.7%)对玉米象的熏蒸与触杀活性，发现驱蛔素的熏蒸与触杀活性均优于土荆芥挥发油，是主要活性成分。本实验所用土荆芥中驱蛔素含量较低，(+)-4-蒈烯和2-蒈烯含量较高，后续研究应采用活性追踪的方法对土荆芥挥发油中杀谷蠹和米象的活性成分进行杀虫活性评价，确定杀虫机理。

4 结论

土荆芥挥发油对谷蠹和米象的熏蒸活性，与目前文献报道的运用类似方法测定的挥发油活性相比，土荆芥挥发油对谷蠹表现出良好的熏蒸活性，对米象的熏蒸活性优于大多数挥发油的活性，但是不及荔枝蝽臭液和小叶薄荷叶子挥发油的活性。植物挥发油对谷蠹和米象触杀活性文献报道较少，土荆芥挥发油对谷蠹的触杀活性优于目前文献报道的灰毛豆树皮、种子和叶子挥发油的活性。土荆芥挥发油对米象的触杀活性优于阳性对照甲氰菊酯和龙舌兰叶子脂溶性烷烃成分对米象的触杀活性。土荆芥挥发油对谷蠹和米象具有良好的驱避活性。仓储害虫的熏蒸剂和防护剂已产生不同程度的抗药性，因此寻找兼有化学农药的速效性和生物农药安全性的高效低毒生物农药已刻不容缓，入侵植物土荆芥的开发与利用为解决这一难题提供了科学参考。