LED光质对食品用小麦芽苗生长和酚类物质累积的影响

(常建伟 杨润强 王 沛 顾振新

(南京农业大学食品科学技术学院，南京 210095)

小麦(TriticumaestivumL.)为禾本科单子叶植物，是我国北方地区重要的粮食作物。小麦籽粒主要用于制粉并加工成面制品。由于小麦磨粉时剔除的胚芽和麸皮中富含蛋白质、脂肪和膳食纤维等营养素[1]，因而小麦籽粒全利用技术研发备受科技工作者的关注。小麦籽粒经发芽形成麦苗后可以进一步提高其营养与保健价值，以此为原料开发功能性食品，达到小麦籽粒及其芽苗全利用的目的。

植物籽粒萌发后，内源酶系被激活，大分子储存性物质降解成更易为人体消化吸收的小分子物质[2]。同时，膳食纤维、叶绿素和维生素，以及酚类物质和叶酸等生物活性物质含量显著增加[3]。研究表明，小麦芽苗有增强人体免疫力、抗氧化、抗疲劳、促进微循环和降低慢性疾病的风险等作用[4]。这些保健作用与其芽苗中独特的酚类物质及其抗氧化特性密切相关[5]。植物酚类化合物主要通过苯丙烷类代谢途径生物合成[6]。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、4-香豆酸-CoA连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)和肉桂酸4-羟化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)是酚类化合物合成途径中的关键酶[7, 8]。酚类物质的合成与积累与这些酶的基因表达密切相关。光照不仅为植物光合作用提供能量，而且还是植物体生长和发育过程中的重要调节因子[9]。种子在萌发和芽苗生长时对光等环境变化尤为敏感[10]。光可以促进植物体内酚酸等次级代谢产物的合成[9]。Liu等[11]发现蓝光处理显著增加豌豆幼苗中绿原酸、没食子酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸含量。紫外光(UV-B)和蓝光处理显著增加萝卜芽苗菜中酚类物质含量和抗氧化能力[12,13]。青钱柳叶在蓝光和绿光处理后酚类含量及抗氧化活性提升[14]。蓝光连续照射显著提高大豆芽苗中黄酮类化合物的含量[15]。这些研究仅在光质对总酚含量和抗氧化能力的变化层面，鲜有涉及酚类物质合成相关酶活性及其基因表达在光质调控酚类物质积累中的作用机制。

本研究用LED光源的白光、红光、蓝光、绿光及黄光处理小麦芽苗，探讨了不同光质下小麦芽苗生长状况、总酚含量、酚酸组成及其抗氧化能力变化，研究了不同光质对小麦芽苗酚类合成关键酶PAL、C4H和4CL活力及其基因表达量的影响，以揭示光质调控酚类物质积累的作用机理，为开发富含酚类的食品用小麦芽苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦(品种：淮麦33号)；酚酸标品：香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸均为分析纯；DPPH(>97%)、ABTS(>98%)、Trolox(>97%)为分析纯；甲醇、乙腈、乙酸为色谱纯。

1.2 主要仪器设备

康丽CB-A321发芽机，LB-300-II光照培养箱，755B 型分光光度计，冷冻离心机，LC-20A型高效液相色谱仪(HPLC)。

1.3 实验设计

小麦籽粒用去离子水冲洗干净，置于1%(V/V)的次氯酸钠水溶液浸泡消毒15 min，然后用去离子水漂洗至pH中性，洗净的小麦籽粒在去离子水中于25 ℃浸泡6 h。籽粒浸泡后移入自动发芽机中，在温度25 ℃、相对湿度85%条件下避光催芽2 d，剔除败芽和死粒后，置于光照培养箱培养。设定白光(W，400～690 nm)、红光(R，600～690 nm，峰值655 nm)、绿光(G，460～597 nm，峰值 520 nm)、蓝光(B，400～500 nm，峰值 445 nm)和黄光(Y，560～650 nm，峰值 595 nm)5种光处理，光照强度为(30±2) μmol/(m2·s)，光周期为光照16 h和黑暗8 h交替进行，光照培养箱内相对湿度为85%，昼夜温度均为25 ℃，以黑暗(D，不进行光照处理)为对照。芽苗生长期间，每小时喷淋1次去离子水，每次1 min，每24 h更换1次培养液。照光培养4 d后取样。

1.4 测定指标与方法1.5 主要生理指标

芽长和根长：随机选取30株小麦芽苗，用游标卡尺测定其芽长和根长，取其平均值，结果表示为cm/株。

鲜质量/干质量：随机选取100株小麦芽苗，准确称取其鲜质量，冷冻干燥后再称取其质量，即为100株小麦芽苗的干质量，重复称量3组，取其平均值。

叶绿素含量：在黑暗条件下，小麦芽苗中叶绿素经80%丙酮提取后，提取液分别在663 nm和645 nm下测定吸光值。

叶绿素a=12.72A663-2.59A645

叶绿素b=22.88A645-4.67A663

1.4.2 酚类化合物含量

采用Chen等[4]方法提取发芽小麦的游离酚和结合酚。总酚含量采用福林-酚法测定[16]，以没食子酸配制标准曲线，总酚含量以 mg GAE/100 g DW 计。酚酸含量参考Wang等[17]的方法测定。样品通过HPLC分析(岛津LC-20A高效液相色谱)，配备C18 110A(5 μm粒径，4.6×150 mm)，流动相A为0.1%的醋酸水溶液，流动相B为甲醇，柱温35 ℃，波长280 nm。根据酚酸标品进行分析和定量，酚酸含量以 μg/g DW计。

1.4.3 自由基清除能力

ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力：参照Chen等[18]和Ma等[16]方法。以Trolox作为标准品，分别在734 nm和515 nm波长下测定吸光值。自由基清除活性用 μmol TE(Trolox equivalents)/g DW表示。

1.4.4 酚类物质合成关键酶活力

PAL活力：参照Chen等[18]的方法，在290 nm下测定OD值。以每小时每克小麦芽苗(鲜质量)酶促反应体系吸光度增加0.01为1个PAL活性单位(U)，表示为0.01ΔOD290/h·g FW。

C4H活力：参照Yan等[19]的方法，在340 nm下测定OD值。以每分钟每克小麦芽苗(鲜质量)酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个C4H活性单位(U)，表示为0.01ΔOD340/min·g FW。

4CL活力：参照陈雷等[20]的方法，在333 nm下测定OD值。以每分钟每克小麦芽苗(鲜质量)酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个4CL活性单位(U)，表示为0.01 ΔOD333/min·g FW。

1.4.5 基因表达分析

PAL、C4H和4CL的引物参考Chen 等[18]的引物序列，如表1所示，由南京某公司合成。取10株液氮速冻后的小麦芽苗，按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。使用反转录试剂盒(Takara, RT-PCR Mater Mix Kit, Catalog No. RR036A)合成第一链cDNA。

表1 qRT-PCR分析引物序列

使用SYBR Premix Ex Taq (Takara, catalog no. RR420A)试剂盒和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行实时荧光定量PCR分析，荧光定量PCR扩增程序为：第一步(预变性)，95 ℃，30 s；第二步(PCR反应)，95 ℃，30 s，再 60 ℃，30 s，循环40次。

1.5 数据统计与分析

实验设3次生物学重复，数据以平均值±标准差表示。采用SAS 9.2软件Duncan’s多重比较法进行显著性分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 小麦芽苗主要生理代谢

从图1可以看出，与对照(D)相比，红光和黄光提高了小麦芽苗芽长和鲜/干质量比，说明红光和黄光增加芽苗含水量，促进其生长。红光和黄光处理的小麦芽苗芽长分别是对照的1.26 倍和1.20倍(图1c)。白光和蓝光显著减少了小麦芽苗的根长，其中白光处理下小麦芽苗根长最短，相较对照减少了9.25%，红光、绿光和黄光对小麦根长无显著影响。小麦芽苗中叶绿素a占总叶绿素含量的77.75%～87.90%(图1b)。白光处理下总叶绿素含量最高，绿光处理下总叶绿素含量最低，较白光(W)下降34.47%，说明绿光不利于叶绿素的积累。图1d显示，红光和黄光处理显著提高了小麦芽苗的鲜/干质量比，分别为对照的1.11 倍和1.09 倍；白光、绿光和蓝光对其则无显著影响。

注：D：黑暗；W：白光；R：红光；B：蓝光；G：绿光；Y：黄光；下同。不同光质处理的前2 d为黑暗催芽，第3天开始照光处理4 d，光强为30 μmol/(m2·s)，光周期为白天16 h，黑暗8 h，取生长6 d的小麦芽苗供实验研究；叶绿素测定时取籽粒上方绿色的茎叶部位作为材料进行叶绿素测定。同一颜色柱上小写字母不同表示不同处理间存在显著差异(P<0.05)，下同。

2.2 小麦芽苗总酚含量

由图2可知，光照处理显著增加了小麦芽苗中总酚含量，以黄光、绿光和蓝光处理的小麦芽苗增加最多，较对照(D)分别增加19.64%、18.21% 和17.99%；白光处理增加最少，仅为对照(D)的1.05倍。光照处理下小麦芽苗中结合酚含量显著高于游离酚含量(P<0.05)，且经过光照处理后，结合酚增加幅度大于游离酚。与对照相比，光照处理显著增加了小麦芽苗中结合酚含量。黄光处理下结合酚含量最高，是对照的1.33 倍。蓝光、绿光和黄光处理显著提高了小麦芽苗中游离酚含量，其中以蓝光处理为最高，达到858.65 mg GAE/100 g DW，较对照增加12.40 %。

注：同一颜色柱子上不同小写字母表示不同处理间存在显著差异(P<0.05)。

2.3 小麦芽苗酚酸含量

不同光质对小麦芽苗中6种主要酚酸含量的影响见表2。小麦芽苗中酚酸以结合态和游离态形式存在，其中阿魏酸最高，达2 420.59～2 668.53 μg/g DW。

表2 不同光质处理下小麦芽苗酚酸含量变化

绿光处理显著增加了小麦芽苗总阿魏酸质量分数，较对照(D)增加了10.24%，其他光质处理对总阿魏酸含量无显著影响。结合态阿魏酸是小麦芽苗中阿魏酸的主要形式，其占总阿魏酸质量分数的76.77%～83.52%。光照处理显著增加了结合态阿魏酸含量，其中绿光处理下结合态阿魏酸含量最高，是对照的1.12倍。而光照处理显著降低了游离态阿魏酸含量。表明光处理使小麦芽苗中阿魏酸由游离态向结合态转化。

光照处理显著增加了小麦芽苗中总对香豆酸含量，其中黄光处理下总对香豆酸含量最高，较对照增加78.36%。除黄光外，其余光处理显著降低了游离态对香豆酸质量分数，降低了15.13%～47.07%；同时，结合态对香豆酸质量分数显著提高，较对照增加43.95%～85.61%。

绿光和黄光处理下总咖啡酸含量显著增加，分别为对照的1.16 倍和1.25 倍。白光处理显著降低了总咖啡酸含量。小麦芽苗中咖啡酸主要以游离态形式存在，其占总咖啡酸的78.51%～87.65%。与对照相比，黄光和绿光显著增加了游离态咖啡酸含量，分别为对照的1.11倍和1.26倍。光照处理均显著增加了结合态咖啡酸含量，其中黄光处理下最高，是对照的1.35 倍。

与对照相比，光照处理均显著增加了总香草酸含量，绿光和黄光处理显著增加了丁香酸总含量，蓝光、红光和白光处理显著增加总芥子酸含量。

2.4 小麦芽苗酚酸合成关键酶活力

如图3a所示，发芽4 d时，白光、红光和黄光处理下PAL活力相较于对照(D)分别增加19.13%、34.82%和30.67%，蓝光和绿光处理下PAL活力与对照无显著差异。发芽6 d时，各光质处理下PAL活力均显著高于对照，其中绿光处理下小麦幼苗中PAL活力最高，是对照的1.51 倍，其次是黄光和蓝光，分别为对照的1.48 倍和1.45 倍。不同发芽时间下光照对C4H的影响存在差异。发芽4 d时，光照处理对小麦苗C4H活力无显著影响，但在发芽6 d时，光照处理均显著提升了C4H活力，且绿光处理下C4H活力最高，是对照的2.29 倍(图3b)。不同的光质处理均显著提升了4CL活力，且绿光处理下4CL活力最高(图3c)。

图3 不同光质处理下小麦芽苗酚类合成关键酶活力变化

2.5 小麦芽苗酚类合成基因表达

如图4a所示，发芽4 d时，白光和绿光处理下PAL表达量较对照(D)分别增加了26.67%和31.50%；发芽6 d时，除红光外，其他光质处理显著增加了PAL表达量，其中蓝光处理下PAL表达量最高，是对照的1.54 倍。由图4b可知，发芽4 d时，绿光和黄光处理显著提高了小麦芽苗中C4H表达量，分别是对照的1.31 倍和1.29 倍；发芽6 d时，光照处理显著提高了小麦芽苗C4H表达量，且绿光处理组C4H表达量最高。4CL表达量在光照处理下显著增加，发芽4 d时，绿光处理组4CL表达量最高，是对照的2.13倍；发芽6 d时，蓝光处理组4CL表达量最高，是对照的2.27倍(图4c)。

图4 不同光质处理下小麦芽苗PAL(a)、C4H(b)和4CL(c)表达量变化

2.6 小麦芽苗抗氧化能力

由图5可知，与对照(D)相比，蓝光、绿光和黄光处理显著增加了小麦芽苗DPPH·和ABTS+·清除能力，各处理组中结合酚的DPPH·和ABTS+·清除活性均显著高于游离酚，这与不同光质处理下总酚含量的变化趋势一致。游离酚中，蓝光、绿光和黄光处理组DPPH·清除活性分别是对照的1.15倍、1.15倍和1.14倍，ABTS+·清除活性分别是对照的1.13倍、1.18倍和1.21倍。结合酚中，蓝光、绿光和黄光处理组DPPH·清除活性分别是对照的1.30倍、1.35倍和1.31倍，ABTS+·清除活性分别是对照的1.12倍、1.18倍和1.14倍。

图5 不同光质处理小麦芽苗ABTS +·和DPPH·清除能力变化

3 讨论

作为冷光源的LED具有光谱集中、光效高、波长类型丰富、光量可调节、环境友好等优点，近年来被广泛应用于设施作物的生理研究与生产中。研究表明，红光在增加小麦芽苗长度、促进细胞呼吸和干物质积累方面有重要作用[21]。本研究发现，红光和黄光显著提高了小麦芽苗的苗长和鲜/干质量比，增加小麦芽苗产量和提高营养价值[22]。另外，红光对小麦芽苗根长的抑制最为显著，这与黄瓜和萝卜离体培养中红光抑制根的生长结果一致[23,24]。光在刺激叶片伸展和叶肉细胞分化的同时，促进原质体或黄化体向叶绿体转化[25]。本研究中，小麦芽苗经光照处理后叶绿素含量增加，且在单色光中以红光处理下总叶绿素和叶绿素a含量最高。据报道[25]，红光可显著提高叶绿素a/b比值，改善叶色。因此，食品用小麦芽苗生产中可以适度提高红光的比例，以增加叶绿素含量。

植物生长发育受到外界环境的影响，幼苗对外界环境的变化尤为敏感。本研究使用LED光源通过精确调节光谱，系统研究了光质对小麦芽苗中酚类化合物积累的影响。小麦芽苗经光照处理后总酚含量(图2)及多种酚酸含量(表2)均有显著增加，其中蓝光、绿光和黄光更有利于酚类物质的积累和增强抗氧化能力(图5)。这可能与缓解植物在单色光胁迫下产生的膜脂过氧化伤害有关[26]。研究表明，UV-B辐射会引起植物体氧化应激反应，抗氧化酶被激活，同时酚类、抗坏血酸和谷胱甘肽等抗氧化物质大量合成，在不同单色光处理下植次级代谢产物的积累可能是植物应对外界环境改变的一种自我防御机制[27]。当植物处于光胁迫时，光合作用和生物量的积累显著降低，但会形成酚类化合物等次生代谢产物，以此提高其抗氧化性。本研究中，光照处理显著提高了小麦芽苗游离和结合酚提取物 DPPH·和 ABTS+·清除能力，特别是蓝光、绿光和黄光对清除率的增加最为显著，表明酚类物质在提高小麦芽苗抗氧化活性方面发挥了重要作用(图5)。植物生长过程中细胞分裂、体积增大，而细胞壁中木质素合成与酚类物质代谢相关，在植物形成木质素的过程中，产生各种酚类中间代谢产物[28]。本研究发现阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸是小麦芽苗中主要的酚酸(表2)，这与Chen等[27]的研究结果一致。蓝光、绿光和黄光处理显著提高了小麦芽苗中结合态阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸含量。这可能与单色光激活小麦芽苗的防御体系，从而激活苯丙烷类及木质素合成代谢途径，进而引起p-香豆酸和阿魏酸的大量形成与积累[27]。香草酸和丁香酸在小麦芽苗中含量较低(表2)，光照对两者的影响较小。

植物中酚类化合物的合成主要通过苯丙烷类代谢途径，其含量的增加与苯丙烷代谢途径中关键酶基因表达及其酶的活力有关[29]。苯丙烷途径基因表达可以被光激活[30]。PAL是该途径的限速酶，本研究中PAL表达量与小麦芽苗中阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸的积累成正相关(图4和表2)，表明PAL表达量及其酶活力的增加使酚类物质得以积累。本研究结果显示，蓝光、绿光和黄光处理可提高小麦芽苗苯丙烷代谢途径中关键基因C4H和4CL的表达量及其酶活性，从而促进酚类物质的积累，这与Liu等[26]和鲁燕舞等[13]的研究结果一致。绿光处理下小麦芽苗有最高的PAL、C4H和4CL表达量及对应的酶活力，因而绿光照射有助于刺激苯丙烷代谢途径，加速小麦芽苗中酚类物质的合成，这为富含抗氧化物质的功能性小麦芽苗食品开发提供了原料。

4 结论

红光和黄光显著增加小麦芽苗的芽长和鲜/干质量比，促进生长。蓝光、绿光和黄光更利于增加小麦芽苗中总酚和酚酸含量，提高抗氧化能力。与对照相比，蓝光、绿光和黄光处理下总酚质量分数增加了17.99%、18.21%和19.64%。阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸在蓝光、绿光和黄光处理下显著提高。蓝光、绿光和黄光通过上调小麦芽苗中PAL、C4H和4CL的表达，提升相应酶活力，促进了酚类物质的合成与积累，从而增强小麦芽苗抗氧化能力。