猪细小病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

刘运超，杨苏珍，陈玉梅，王聚财，尚延丽，魏 蔷，陈维聪，冯 华，张改平

（1. 河南省农业科学院 动物免疫学实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2. 郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001）

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）于1965年首次在德国发现，是导致猪繁殖失败的主要病原体之一，临床上以怀孕母猪发生死胎、木乃伊化和发情延迟为主要特征[1-2]，给全球养猪业造成巨大经济损失[3]。我国猪场PPV 检出率高，常与其他繁殖障碍性疾病病原如猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV）等混合感染，加重了疾病防控难度[4]。

PPV 属于细小病毒科、细小病毒属，是一种单链、无囊膜的DNA 病毒，病毒粒子直径为18～26 nm，呈T=1的二十面体结构[5-6]。PPV 基因组全长约5 000 bp，主要包含2 个开放阅读框（Open reading frame，ORF），其中ORF1 编码非结构蛋白NS1、NS2 和NS3，主要参与病毒DNA 复制和基因表达调控[7-8]；ORF2 编码结构蛋白VP1、VP2 和VP3，主要参与病毒的组装和感染过程，与病毒的附着、进入、定位和病毒粒子组装密切相关[9-10]。PPV 的衣壳结构主要由VP1 和VP2 蛋白组成，比例约为1∶20[11]。VP2 蛋白由VP1 蛋白经剪切去除VP1 蛋白N端的150 个氨基酸形成[12]，而VP3 蛋白由VP2 蛋白经剪切水解形成[13]。VP2蛋白是PPV 的主要衣壳蛋白，包含PPV 的血凝（Hemagglutination，HA）活性位点和多个中和性抗原表位，可在体外自组装成病毒样颗粒（Viral-like particles，VLP）结构，诱导中和性抗体产生[14-16]。

中和性单克隆抗体具有特异性强、敏感性高，能够阻断病毒感染等特点，被广泛用于病毒的免疫学检测、免疫保护评价和病毒感染机制研究等领域[17-20]。孙建慧等[21]利用杆状病毒表达的重组PPV VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后采用免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）筛选，共获得8 株抗PPV 的单克隆抗体，这些单克隆抗体均与PPV 感染的猪睾丸细胞反应。刘秀芬等[22]利用干酪乳杆菌表达的重组PPV VP2 蛋白免疫BALB/c 小鼠，共获得5 株抗PPV 单克隆抗体。但抗PPV 中和性单克隆抗体的研究鲜有报道。为此，以重组PPV VP2 蛋白组装的VLP抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合和IPMA 筛选，制备具有中和PPV 感染活性的单克隆抗体，并对抗体的特异性、敏感性和中和效价进行测定，旨在为PPV 中和性抗原表位研究和免疫检测试剂开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 细胞株SP2/0、PK15、Mac145和病毒株PPV、猪圆环病毒2 型（Porcine circovirus 2，PCV2）、PRRSV、猪 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）均由本实验室保存。其中，SP2/0细胞用于与BALB/c 小鼠脾细胞融合；PK15细胞用于PPV、CSFV、PCV2 的增殖；Mac145 细胞用于PRRSV的增殖。

1.1.2 供试动物 6～8 周龄雌性BALB/c 小鼠及经产母鼠均购自郑州大学医学院实验动物中心；6～8周龄雌性BALB/c 小鼠用于单克隆抗体制备，经产母鼠用于单克隆抗体腹水的制备。

1.1.3 主要试剂 抗PCV2 单克隆抗体培养上清、PPV 阳性猪血清，均由本实验室保存；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗His 标签单克隆抗体购自Proteintech 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG、HRP 标记的羊抗猪IgG 购自武汉三鹰生物技术有限公司；RPMI 1640、DMEM 培养基、FBS胎牛血清购自Gibco公司；HT、HAT 培养基、PEG1500、弗氏佐剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重组PPV VP2 蛋白的鉴定 纯化的重组PPV VP2 蛋白由本实验室制备[23]。采用SDS-PAGE和HA 鉴定重组PPV VP2 蛋白的纯度和血凝活性。稀释重组PPV VP2 蛋白至抗原HA 效价为1∶215，保存备用。

1.2.2 动物免疫 将5 只BALB/c 小鼠随机分为2组，免疫PPV 组3 只小鼠，免疫原为重组PPV VP2抗原，将HA 效价为1∶215的PPV VP2 蛋白与等体积弗氏佐剂混合乳化后免疫小鼠。对照组2 只小鼠，接种PBS 缓冲液。采用皮下多点注射免疫，共免疫3 次，每次100 μL，免疫间隔14 d。初次免疫使用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂。第3 次免疫后14 d，小鼠断尾采血，采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和血凝抑制试验（Hemagglutination inhibition，HI）检测小鼠血清中抗PPV 特异性抗体效价，选定效价最高小鼠腹腔注射25 μg（体积50 μL）重组PPV VP2 蛋白，进行加强免疫，加强免疫后3 d进行细胞融合。

1.2.3 细胞融合与阳性杂交瘤细胞株的筛选 取加强免疫后3 d 的BALB/c 小鼠，脱颈处死，无菌取出小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，与SP2/0 细胞按照5∶1的比例混合，逐滴加入PEG1500进行细胞融合。以HAT 选择培养基稀释融合后细胞，将悬浮细胞均匀铺至20 块96 孔细胞培养板中，每孔300 μL，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养10 d。以IPMA 进行阳性克隆筛选，以有限稀释法对阳性细胞孔连续进行亚克隆，获得能稳定分泌抗PPV 的阳性单克隆杂交瘤细胞株。

1.2.4 IPMA 试验 按每孔6×105个细胞将PK15 细胞铺至96 孔细胞培养板，37 ℃、5%CO2培养至细胞铺满孔底80%，每孔接种200 TCID50PPV，37 ℃、5%CO2继续培养72 h。以含4% H2O2的甲醇溶液固定96 孔板中细胞15 min，弃固定液，加入含5%脱脂牛奶粉的PBST 缓冲液，4 ℃封闭过夜。弃封闭液，按照每孔50 μL的量向细胞培养孔中加入按比例倍比稀释的杂交瘤细胞培养液上清或单克隆抗体腹水，37 ℃孵育20 min 后，以PBST 洗涤6 次，按照每孔50 μL 加入1∶1 000 稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，弃去培养板中溶液，以PBST 洗涤6 次，双蒸水洗1 次，每孔加入100 μL AEC 显色液，室温显色10 min，倒置显微镜下观察。

1.2.5 病毒中和试验 按照参考文献[24]所述，采用病毒中和试验筛选中和性单克隆抗体，设抗PCV2 单克隆抗体培养上清为阴性对照（Negative control，NC）。将PPV 用无血清培养基稀释至200 TCID50，与杂交瘤细胞培养上清1∶1（V/V）混合，37 ℃孵育1 h。向96 孔细胞培养板中培养的PK15 细胞加入上述混合物，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2孵育2 h。弃去细胞板中液体，加入含2% FBS 的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2培养20 h。弃去培养上清，加入含有4% H2O2的甲醇固定液，室温孵育15 min。以1∶500稀释的PPV 阳性猪血清为一抗，1∶1 000稀释的HRP 标记的羊抗猪IgG 为二抗，参照IPMA 方法检测培养孔中PPV 增殖情况，筛选具有中和PPV感染活性的杂交瘤细胞株，将阳性细胞株扩大培养，液氮保存。

1.2.6 单克隆抗体腹水的制备及效价测定 将阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，收集备用。取经产BALB/c 母鼠，腹腔注射液体石蜡（0.5 mL/只），10 d后腹腔注射2.5×106个杂交瘤细胞（0.5 mL/只）。8～12 d 后，待小鼠腹部明显膨大，抽取腹水。10 000 r/min 离心10 min，收集上清，-70 ℃以下冻存备用。分别用纯化的重组PPV VP2 蛋白和PPV 病毒粒子作为包被原，将10 倍稀释的单克隆抗体腹水2 倍倍比稀释后作为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 作为二抗，建立ELSIA 方法测定单克隆抗体腹水效价，每个样品重复3 次，以阴性孔OD450值2.1 倍为阈值，判定为阳性。

1.2.7 单克隆抗体的特异性鉴定 采用IPMA 法鉴定单克隆抗体的特异性。分别取PPV、PRRSV、CSFV、PCV2 感染的细胞，以1∶5 000 稀释的抗PPV单克隆抗体腹水为一抗、HRP 标记的羊抗鼠IgG 抗体为二抗，参照上述IPMA 方法，鉴定单克隆抗体的特异性。

1.2.8 单克隆抗体的Western blot 鉴定 将纯化的重组PPV VP2 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，随后转印硝酸纤维素膜，以1∶5 000 稀释的抗PPV 单克隆抗体腹水为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot 检测，设置抗His 标签单克隆抗体为一抗作为阳性对照。

1.2.9 单克隆抗体病毒中和效价检测 将纯化的单克隆抗体腹水系列稀释后与200 TCID50的PPV 混合，然后将混合物加入到长满PK15 细胞的96 孔培养板。参照1.2.5中的方法，以PPV阳性猪血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG抗体为二抗，以腹水完全抑制PPV 病毒增殖的最高稀释倍数作为最终的抗体中和效价。

1.2.10 单克隆抗体亚型鉴定 按照Proteintech 公司小鼠单克隆抗体亚型鉴定用ELISA 试剂盒说明书进行操作。

2 结果与分析

2.1 PPV VP2蛋白纯化结果

SDS-PAGE 结果表明，大肠杆菌表达的重组PPV VP2蛋白分子质量约为64 ku，蛋白质纯度可达80%以上（图1A），纯化的VP2 蛋白具有类似天然PPV 病毒粒子的凝集小鼠红细胞的HA 活性，HA 效价为1∶214（图1B）。

2.2 BALB/c小鼠血清效价

为了检测小鼠的血清效价，在第3 次免疫后第14天，采用间接ELISA和HI方法检测小鼠血清中的抗体水平。结果显示，免疫PPV VP2 蛋白组小鼠产生了抗PPV VP2 蛋白的特异性抗体，其ELISA 效价在1∶214～1∶216，HI 效价可达1∶216，免疫PBS 对照组BALB/c小鼠未检测到抗PPV VP2抗体（表1）。

表1 免疫BALB/c小鼠血清效价Tab.1 Serum titer of immunized BALB/c mice

2.3 抗PPV中和性单克隆抗体的筛选

通过经典的杂交瘤融合技术制备杂交瘤细胞株，经有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，以IPMA 方法筛选特异性识别PPV 的单克隆抗体，并采用1.2.5 所述病毒中和试验方法从抗PPV 特异性抗体中筛选具有中和PPV 感染活性的杂交瘤细胞株，共筛选到2 株中和性单克隆抗体5F7 和11B3。IPMA 结果显示，单克隆抗体5F7 和11B3 均能与PPV 发生特异性反应（图2）。将200 TCID50PPV 分别与梯度稀释的单克隆抗体混合，进行病毒中和试验，结果显示，5F7 和11B3 的中和效价分别为1∶211和1∶210。

2.4 抗PPV中和性单克隆抗体的鉴定

2.4.1 ELISA 检测结果 用间接ELISA 方法，以单克隆抗体5F7 和11B3 腹水和杂交瘤培养上清为一抗，检测PPV 与重组VP2 蛋白的反应性。结果显示，5F7 和11B3 两株单克隆抗体均与PPV 和重组VP2 蛋白发生特异性结合，其中单克隆抗体5F7 和11B3 杂交瘤细胞株培养上清对重组VP2 蛋白的效价分别为1∶6 400 和1∶12 800（图3A）；5F7 和11B3腹水对重组VP2 蛋白的效价均为1∶4 096 000，与PPV的结合效价可达1∶10 240和1∶20 480（图3B）。

2.4.2 Western blot 分析 将纯化的重组PPV VP2蛋白进行SDS-PAGE 电泳，转印硝酸纤维素膜，分别以5F7 和11B3 腹水为一抗进行Western blot 检测，结果如图4所示。2株单克隆抗体5F7（图4A）和11B3（图4B）不能与变性的VP2 蛋白结合，而抗His标签单克隆抗体可以与变性的重组VP2 蛋白结合（图4C），说明5F7 和11B3 识别的抗原表位为构象表位。

2.4.3 单克隆抗体特异性分析 2 株中和性单克隆抗体的腹水1∶5 000 稀释后，与不同病毒进行IPMA检测，结果如图5 所示。2 株中和性单克隆抗体5F7、11B3只与PPV反应，与PCV2、PRRSV、CSFV 等病毒均不反应，表明本研究筛选的中和性单细胞株 具有良好的特异性。

2.4.4 单克隆抗体亚型鉴定 单克隆抗体5F7 和11B3 分属于2 种不同的抗体亚型，其重链分别为IgG2a和IgG2b，轻链均为Kappa（图6）。

3 结论与讨论

PPV 是一种引起猪繁殖障碍性疾病的病毒，给养猪业带来巨大经济损失，威胁生猪种质资源安全。VP2 蛋白是PPV 的主要结构蛋白，含有重要的抗原表位，可诱导机体产生特异性的中和抗体，是制备PPV 单克隆抗体的理想抗原[25]。PPV VP2蛋白已在杆状病毒表达系统和大肠杆菌表达系统中成功表达[26]。笔者所在课题组前期制备了大肠杆菌表达的重组PPV VP2 蛋白，并在体外自组装形成VLP结构，该VLP 具有血凝活性，能够诱导机体产生高滴度的中和性抗体[27]。在此基础上，本研究以重组PPV VP2 蛋白为抗原与佐剂混合乳化后免疫BALB/c 小鼠，经细胞融合和IPMA 筛选，获得2 株具有中和PPV感染活性的单克隆抗体5F7和11B3。

本研究以重组VP2 蛋白血凝效价为免疫单位，而不仅仅以VP2 蛋白的含量为依据进行免疫，有效诱导小鼠中和抗体的产生，提升了中和性单克隆抗体的筛选效率。经该方法制备的单克隆抗体5F7和11B3 均与重组PPV VP2 蛋白和PPV 病毒粒子发生特异性反应，提示2 株单克隆抗体能够识别重组PPV VP2蛋白和PPV病毒粒子表面B细胞表位。同时，Western blot检测结果显示，2株单克隆抗体与变性的重组PPV VP2 蛋白均不反应，表明在变性条件下被单克隆抗体识别的抗原表位发生变化，提示这2 株中和性单克隆抗体仅识别重组VP2 蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果显示，单克隆抗体5F7中和PPV 感染效价可达1∶211，单克隆抗体11B3 的中和效价1∶210，均具有较高的中和病毒感染活性。经鉴定，2 株单克隆抗体的轻链均为Kappa 型，5F7的重链为IgG2a 亚型，11B3 的重链为IgG2b 亚型，2株单克隆抗体均具有良好的特异性，不与PCV2、PRRSV 和CSFV发生交叉反应。中和性单克隆抗体特异性识别抗原的中和性表位，利用中和性单克隆抗体进行抗原表位的定位，是研究B 细胞抗原表位的经典方法。同时，中和性单克隆抗体能够有效阻断病毒对宿主细胞的侵染，防止病毒进入宿主细胞，具有被开发为治疗性药物的潜力。

本研究成功获得了2株针对PPV VP2蛋白构象表位的特异性中和单克隆抗体，可为进一步研制PPV 抗原免疫检测产品提供技术支撑，同时为PPV中和性表位鉴定和病毒吸附、感染机制等方面的研究奠定基础。