DNA 病毒基因组复制与宿主细胞DDR 信号网络互作的研究进展

王平利，夏 璐，魏战勇

（河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450046）

病毒是一类超显微的非细胞生物，只能在活细胞内专性寄生，依赖于宿主细胞的代谢系统来合成自身的核酸、蛋白质进行装配而得以繁殖。病毒从感染宿主细胞到从宿主细胞中释放出来分为5个阶段，即侵入、脱壳、复制及合成、装配、释放。每个阶段都依赖于宿主细胞，给细胞生存带来压力。DNA病毒感染过程中与宿主细胞各代谢途径发生广泛的互作，如劫持细胞蛋白质的翻译过程、改变细胞脂类代谢途径、利用细胞DNA 复制系统等，进而改变细胞内环境以完成病毒复制[1-3]。细胞DNA 损伤反应（DNA damage response，DDR）是维持细胞基因组稳定的重要途径。研究表明，DNA 病毒感染能够诱导宿主细胞DDR[4-7]。该反应是一种细胞防止病毒入侵的自我保护机制。DNA 病毒在长期进化过程中获得了相应的功能来对抗宿主细胞的DDR，从而消除细胞DDR 对病毒复制产生的不利影响[8-9]。RNA 病毒中除少数逆转录病毒外，大部分RNA 病毒在胞浆中复制，对细胞DNA 的损伤没有DNA 病毒影响普遍，这里不再赘述。现就DNA病毒基因组复制过程中与宿主细胞DDR 信号网络之间的互作机制进行综述，为揭示DNA病毒致病和诱导细胞天然免疫反应的分子机制提供参考。

1 细胞DNA损伤反应

真核细胞进化获得了复杂的调控机制以保证DNA 复制的忠实性[10-11]。为防止细胞基因组发生改变，细胞进化获得了复杂的分子机制感知DNA 损伤，传递信号引发细胞周期停滞，激活相应的DNA修复系统。当细胞处于复制应激或受到内、外DNA损伤因素威胁时，启动细胞DDR可以保护细胞基因组的稳定和完整性[12-14]。DNA 双链断裂（Doublestrand break，DSB）和单链断裂（Single-strand break，SSB）都可以激活细胞DDR。细胞DDR 是一个复杂的信号网络系统（图1）[1]。DDR系统包括感知分子、信号传递分子和效应分子。MRE11-RAD50-NBS1（MRN）蛋白复合物和Ku70/80 感知DSB，复制蛋白A（Replication protein A，RPA）感知SSB。DNA 损伤感知分子诱导激活3 种磷脂酰肌醇-3 激酶样激酶PI3KK（Phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase）中的1 种，包括ATM（Ataxia telangiectasia mutated）、ATR（Ataxia telangiectasia and Rad3 related）、DNAPKcs （DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）。MRN 感知DSB 后激活ATM，Ku70/80 感知DSB 后激活DNA-PKcs，SSB 被RPA 识别后激活ATR，这些激酶被激活后将损伤信息传递给下游效应分子[13-14]。ATM 和ATR 磷酸化下游底物CHK2（Serine/threonine-protein kinase Chk2）、CHK1（Serine/threonine-protein kinase Chk1）、H2AX（Histone H2AX）、MDC1（Mediator of DNA damage checkpoint protein 1）、p53等，DNA-PKcs磷酸化p53、H2AX。修复反应蛋白TP53BP1（Tumor suppressor p53-binding protein 1）、RIF1（Rap1-interacting factor 1）、BRCA1（Breast cancer type 1 susceptibility protein）、CtIP（CtBP-interacting protein）等被募集到损伤处，和细胞 周 期 调 控 分 子 CycE/CDK2（Cyclin-E/Cyclin-dependent kinase 2）、CycB/CDK1（Cyclin-B/Cyclin-dependent kinase 1）等协作诱导细胞周期阻滞，修复DNA 损伤[15]。DSB 发生在G1期时，细胞以非同源末端连接（Nonhomologous end joining，NHEJ）方式修复DSB；当DSB发生在S和G2期时，细胞通过同源重组修复（Homologous recombination repair，HRR）方式修复DSB。

2 DNA病毒基因组结构特征和复制特点

DNA 病毒种类繁多，基因组长度和编码复杂程度变化很大，每种病毒编码一套特有的蛋白质参与其基因组复制。DNA 病毒基因组越小，编码能力就越小，需要更多地依赖于宿主细胞DNA 复制系统。细小病毒是最简单的DNA 病毒，如腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、鼠细小病毒（Minute virus of mice，MVM），基因组为单链DNA，长4.5～5.0 kb，基因组两端有末端反向重复序列（Inverted terminal repeat，ITR）。ITR 可以启动复制，并结合宿主修复蛋白。细小病毒只有1个病毒基因编码的非结构蛋白NS/Rep（Nonstructural protein/replication protein）参与复制过程，所以这类病毒基因组复制在很大程度上依赖于细胞的复制系统[16]。多瘤病毒（Polyomavirus）基因组是约5.0 kb 的环形dsDNA，被包装成含有细胞组蛋白的微型染色体，基因组复制是由一个被称为大肿瘤抗原L-TAg（Large tumor antigen）的多功能病毒蛋白与特定的DNA 复制起始点结合完成的[17]。乳头瘤病毒（Papillomavirus）基因组是约8.0 kb 的环形dsDNA，在其上游调控区域内含有1 个复制起始点，早期基因编码2 个复制蛋白（E1和E2）和3个辅助蛋白（E5、E6和E7），它们通过操纵细胞DNA 复制系统促进病毒DNA 复制，使病毒基因组持久存在于细胞内[18]。 腺病毒（Adenovirus，ADV）基因组是线性dsDNA。ADV 编码ssDNA 结合蛋白、病毒DNA 聚合酶、末端蛋白3种蛋白质，其中末端蛋白作为蛋白质引物起始链取代模式DNA 复制[19]。疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）具有不同大小的dsDNA 基因组，单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）基因组约152.0 kb，EB 病毒（Epstein-barr virus，EBV）约172.0 kb，卡波西肉瘤相关 疱 疹 病 毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）约140.0 kb。HSV-1 编码7 个复制必需的蛋白质，基因组含有3 个复制起始位点。DNA 病毒基因组复制的共同特点是病毒表达合成与病毒DNA 结合的蛋白质识别复制起始位点，募集其他细胞和病毒蛋白质合成DNA。

3 DNA病毒与细胞DDR信号网络之间的相互影响

现已明确细胞DDR 可以识别DNA 病毒感染带来的外源性DNA，DNA 病毒与细胞DDR 之间发生广泛的相互作用[1-3]。感知DNA 病毒基因组和激活细胞DDR 信号系统可以发生在DNA 病毒感染的不同阶段，包括病毒DNA 进入细胞核初期、活跃复制阶段、病毒DNA 整合到宿主基因组过程、病毒基因组独立于宿主基因组建立持续感染时期等。DDR信号网络可以将病毒基因组中的特殊结构（如ssDNA 发卡结构和线性dsDNA 基因组末端）识别为DNA 损伤结构，对病毒基因组的复制构成威胁。反过来，DNA 病毒进化获得了对抗和利用细胞DDR的功能，将DDR 作为病毒DNA 成功复制的独特工具箱，处理病毒复制中间体结构。病毒蛋白还可以诱导细胞DNA 复制应激而影响细胞DDR 过程。DNA 病毒激活各自特异的DDR 激酶信号通路，但又与经典的细胞DNA 损伤反应通路不同。DNA 病毒感染激活的DDR 信号通路是细胞对病毒复制所做出的应激反应，还是病毒主动诱导的促进病毒基因组复制的反应，二者难以区别。不同DNA 病毒调控细胞DDR信号途径的机制详见表1。

表1 DNA病毒调控细胞DDR的不同机制Tab.1 Different mechanism of DNA virus regulating cellular DDR

3.1 DNA病毒选择性激活DDR信号网络途径

腺病毒[20-21]、多瘤病毒[22]和疱疹病毒[6，23]感染细胞时都可以激活细胞DDR，最简单的细小病毒与DDR 信号网络也发生复杂的相互作用[7，24]。细小病毒感染激活多种PI3KK，诱导广泛的DDR 信号途径[25]。MVM 仅激活ATM，同时完全抑制ATR 和CHK1[26]。AAV 与腺病毒共同感染时激活DNAPKcs，但与HSV-1共感染时主要激活ATM[27]。MRN复合物结合于AAV 的ITR 对病毒复制产生不利影响，但却促进了病毒DNA 融合到宿主细胞基因组中[28]。多瘤病毒是研究DNA 复制的强有力工具，其L-TAg 通过调控细胞转录机制而上调DDR 反应组分，激活ATM 和ATR，如SV40（Simian virus 40）[29]、JC多瘤病毒（JC polyomavirus，JCPV）、Merkel 细胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCV）[30]。L-TAg与复制起始位点结合促进病毒DNA 的合成，同时激活细胞DDR。L-TAg被ATM 磷酸化，获得处理病毒复制中间体结构的功能，若抑制ATM 和ATR，则限制了多瘤病毒复制。人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）复制也利用细胞DDR，ATM 和下游修复蛋白RAD51、BRCA1 在HPV 复制过程中发挥了重要作用[31-32]。HPV诱导ATM高度活化并磷酸化下游效应蛋白CHK2，造成G2期阻滞，这是病毒基因组复制所必需的[33]。单独表达HPV E1和E7蛋白，二者都能够诱导ATM 磷酸化，增加DNA 修复蛋白的量，修复蛋白是促进病毒复制所必需的[34]。HSV-1 通过病毒蛋白ICP4 和基因组激活ATM，利用角膜上皮细胞DDR 完成基因组复制过程[35]。即使在同一个保守的病毒家族中，激活的DDR 信号通路也有细微差异，不同血清型之间的差异表明了各病毒激活不同的DDR通路。

3.2 DNA病毒选择性抑制DDR信号网络途径

DNA 病毒能够选择性利用DDR 信号网络促进病毒的复制，但有些情况下，DNA 病毒感染激活DDR 后，对病毒复制会产生不利影响。DNA 病毒基因组刚进入细胞核时就被核内的外源DNA 感知蛋白识别[36-37]，感知蛋白募集宿主细胞抗病毒蛋白复合物在入核的病毒DNA 基因组处聚集，启动细胞内源性抗病毒反应[38]。DNA 病毒进入细胞核时，病毒表达早期蛋白，可降解细胞内源性的抗病毒蛋白复合物。

AAV 感染时，MRN 复合物被AAV 早期蛋白E1和E4 灭活，MRN 下游的通路被抑制，防止病毒基因组被破坏[8]。MVM 感染早期募集结合MRN复合物，但后期将其降解。腺病毒蛋白通过抑制DNA-PKcs和DNA 连接酶Ⅳ的活性而抑制NHEJ 修复途径，还可通过抑制TOPBP1（DNA topoisomerase 2-binding protein 1）来抑制ATR通路。

HSV-1 基因组是线性dsDNA，有双链缺口和单链间隔，这些结构特点能够募集、结合并激活细胞DDR。其中，RNF8（RING finger protein 8）、RNF168（RING finger protein 168）、BRCA1 是细胞内源性抗病毒蛋白，但很快被HSV-1 编码的E3 泛素连接酶ICP0 灭活[9]。DDR 上游蛋白质γ-H2AX 和MDC1 结合在入核的病毒基因组上，但下游的修复蛋白RNF8 和RNF168 被ICP0 介 导降 解，阻 止TP53BP1结合到病毒基因组[36]。DNA 病毒针对不同DDR 组分的不同处理方式提示，DDR 信号通路上游蛋白质可能被HSV-1利用，进而参与病毒基因组的重组形式复制，下游蛋白质被降解清除，防止其沉默病毒基因组。在裂解感染和潜伏感染时期，HSV-1 分别表达特异蛋白质，选择性地调控DDR 修复途径。HSV-1 单链DNA 结合蛋白ICP8 与病毒的UL12 外切酶形成复合物，促进依赖于重组修复的病毒DNA复制，通过单链退火和末端切除来抑制其他形式的末端连接。ICP0 泛素连接酶介导降解DNA-PKcs、MRE11，阻止了病毒末端连接，促进了病毒复制。HRR 促进HSV-1 复制，NHEJ 可能对HSV-1 的复制产生抑制作用，这可以解释为什么病毒蛋白靶向抑制NHEJ 的通路蛋白。前人研究发现，抑制DNAPKcs 或敲减Ku80基因可以促进KSHV 的复制[39]。DNA 病毒进化获得了逃脱细胞针对外源性DNA 的识别机制，抑制细胞内源性抗病毒反应。

3.3 DDR信号网络调控DNA病毒的感染状态

疱疹病毒感染的一个特征是呈现溶解性感染和持续性潜伏感染双阶段。潜伏感染时，如HSV-1感染神经细胞，EBV 感染B细胞[40]，病毒基因组持续存在但没有子代病毒粒子生成。细胞DDR 促进了病毒潜伏感染，在病毒活化时又被重新调控。由于DDR在HSV-1裂解感染过程中很重要，而不同细胞DDR 通路的差异则促进了HSV-1 潜伏感染。HSV-1 感染神经细胞时激活DDR 的程度不同于非神经细胞[41]。ICP0 介导降解RNF8 和RNF168，阻止组蛋白的泛素化和下游修复蛋白的募集[36]，这有助于在神经元建立潜伏感染。KSHV 早期感染原代内皮细胞时激活ATM，对感染晚期建立潜伏感染很重要。DDR 组分在感染后期也发挥重要作用，通过多聚ADP 核糖募集结合出核复合物UL31，促进KSHV释放出细胞核[42]。

3.4 DNA病毒通过调控DDR信号网络影响宿主细胞基因组的稳定性

致瘤病毒能够诱导转化肿瘤细胞，其基因组的不稳定性可能由几种因素共同促成，包括病毒感染诱导复制应激致使细胞DNA 损伤、DNA 损伤检查点被抑制、病毒DNA 随意整合、整合后的病毒基因组发生扩增和结构重排等。DDR 是细胞固有的肿瘤抑制反应，疱疹病毒感染时调控、改变细胞DDR，促进细胞发生肿瘤性转化。EBV 通过下调保持基因组完整性的蛋白质功能促进细胞发生肿瘤性转化[43-44]。EBV 潜伏感染蛋白EBNA3C 抑制ATMCHK2 通 路，促 进B 细 胞 扩 增 和 永 生 化[45]。HPV DNA 的复制损伤了宿主细胞DNA，造成宿主细胞基因组不稳定。HPV 感染诱导形成不稳定的恶性肿瘤细胞基因组，致使大量染色体发生结构异常，形成微细胞核。HPV E6 蛋白抑制了p53 的功能，E7干扰了肿瘤抑制因子pRb，导致中心体复制错误。HPV 抑制这些细胞周期检查点蛋白可以导致分化完全的角质细胞进入S 期，使得HPV 基因组充分复制，直接损害了宿主细胞基因组的完整性。E6 和E7 诱导细胞DNA 复制应激，明显减少核苷酸的储备 量，导 致 细 胞DNA 损 伤[46]。FANCD2（Fanconi anemia group D2 protein）负责保护停滞的细胞基因组复制，在HPV 复制中心处异常累积，去除FANCD2导致HPV E7 转基因小鼠易发生头颈部肿瘤。以上研究结果提示，病毒感染诱导的细胞DNA 损伤和复制应激是促进细胞肿瘤化的主要驱动因素。

4 DNA病毒复制中心与DDR反应灶之间的相互影响

细胞DNA 在核内离散位点处复制，参与复制的蛋白质集中分布在这些位点。而DNA 病毒复制发生在病毒诱导的特异结构处，被命名为VRC（Viral replication center）[47-48]。病毒和一些参与细胞DNA复制、修复的蛋白质集中分布在VRC 处，促进病毒DNA 的复制和转录，而那些对病毒复制有潜在危害的宿主细胞蛋白质则被移除在VRC 之外。每一种DNA 病毒都募集特异的细胞DNA 复制和修复蛋白[49-53]，这些蛋白质或被利用，或被灭活，即使在高度保守的同一病毒属内相互之间也会有差异。

4.1 DNA病毒VRC选择募集细胞DDR反应组分

从简单到复杂的病毒基因组复制中心选择性地募集了许多宿主细胞DNA 复制和修复蛋白。如细小病毒形成的复制中心即APAR 小体[Autonomous parvovirus associated replication（APAR）body]结合了参与细胞DNA 复制、修复蛋白和病毒非结构蛋白NS1[16，25]，NS1 负责把MVM 的基因组定位到DNA 损伤灶处[54]。AAV 的VRC 募集结合的DDR 组分包括激活的ATM 和DNA-PKcs[27]，由复制蛋白Rep 和ITR 形成的复制起始位点结合了DNA-PKcs 和Ku70/80 蛋 白[55]。多瘤病 毒依靠LTAg 和复制的病毒基因组募集细胞DNA 修复蛋白到VRC[56]，抑制ATM 和ATR限制了多瘤病毒形成分散的VRC[30]，而激活ATM 则影响病毒对DDR 信号途径的选择。ATM 阻止NHEJ 相关蛋白质复制SV40 DNA，从而防止病毒基因组发生连环化，因为连环化会破坏病毒DNA 的有效复制。SV40 VRC 处的ATM 促进募集切除酶，抑制ATM，导致DNAPKcs和NHEJ相关蛋白质的累积和活化[57]。在HPV感染的细胞内，参与DNA 同源重组修复和保护复制叉 的DDR 反 应 组 分，如MRN、BRCA1、ATRIP（ATR-interacting protein）、RAD51、FANCD2、CHK2被募集结合在HPV VRC 处，通过同源重组或处理病毒DNA 复制中间体结构的方式促进病毒复制。当共同表达HPV 复制蛋白E1 和E2 时，形成的核内VRC 募集结合了许多宿主细胞DNA 修复蛋白[58]。在HSV-1 发生裂解感染或潜伏感染被激活时，HSV-1 的VRC 处都募集结合了许多DNA 修复蛋白。在HSV-1 和KSHV 的VRC 中 都 有MRN 和Ku70/80 复合物，但没有发现下游参与HRR 的蛋白质。MRN 复合物在许多DNA 病毒感染时都结合到VRC 处，去除MRN 复合物降低了HSV-1 和KSHV复制效率，可能与MRN 激活ATM 有关。MRN 复合物具有重要的外切酶功能，用抑制剂消除其功能后，KSHV 的重新复活受到抑制。痘病毒在胞质内的VRC 复制DNA，参与细胞DNA 复制和修复的蛋白质如拓扑异构酶和PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）在胞浆中的VRC 集中分布，胞质内的VRC 同样募集结合MRN 和DNA-PKcs 等DDR 反应组分[59]。

VRC 募集结合的细胞DNA 复制和修复蛋白促进了病毒复制，滞留DDR 反应组分可能从空间上阻止了它们参与宿主细胞DNA 损伤的修复反应，造成宿主细胞基因组不稳定。DNA 病毒VRC 选择性地募集结合DDR 反应组分能够更好地利用细胞的某些代谢途径来复制病毒基因组。

4.2 DNA 病毒蛋白将不利于DNA 病毒复制的DDR组分降解移除

对DNA 病毒复制有害的宿主细胞蛋白被病毒蛋白靶向降解或者移位。尽管MRN 复合物被一些DNA 病毒利用，但它不利于某些DNA 病毒的复制，所以被特异性地从VRC 中去除。腺病毒VRC 中的MRN 复合物被E4orf6-E1b55K 病毒蛋白靶向降解，并且被E4orf3 蛋白移除到胞浆。当这些病毒早期基因产物不表达时，MRN 复合物与VRC 中的病毒基因组DNA 结合[8]，限制病毒DNA 复制，导致形成病毒连环体，其详细机制还不明确。MVM选择性地移除MRE11 和p21[60]，以保证细胞处于有丝分裂前状态，有利于MVM 复制。HSV1 ICP0 靶向降解MRE11，消除细胞内源性的抗病毒成分[61]。有些DNA 病毒蛋白还靶向降解ATM、DNK-PKcs、TOPBP1、p53等（表1）。值得注意的是，同一个蛋白质既可以被激活，也可以被病毒蛋白诱导降解。这提示同一蛋白质在病毒感染的不同阶段对病毒的复制产生了有利或有害的影响，所以被病毒在不同感染阶段选择性激活或降解。

5 结论与展望

DNA 病毒复制与细胞DDR 信号网络之间发生复杂的相互作用。由于病毒基因编码能力有限，所以病毒必须选择性地结合、利用有利于病毒复制、重组的DDR 组分，同时降解、移除对病毒基因组复制有害的DDR 组分，将它们排除在VRC 之外。DNA 病毒通过激活细胞DDR 信号网络中的ATM、ATR、DNA-PKcs，改变细胞内环境，完成病毒感染周期。然而，DNA 病毒感染与细胞DDR 之间相互作用的机制还有许多未解之谜，DNA 病毒感染激活的DDR 信号网络与经典的细胞DDR 信号网络的区别还不明确。有关DNA 损伤激活的DDR 和外源性DNA 感知分子cGAS、IFI16、RIG-I、STING 等所激活的天然免疫之间联系已经进行了探索研究[62-65]，已有利用核酸免疫治疗由DNA 病毒（如HPV）所引发的肿瘤[66]，这是肿瘤免疫治疗的一个发展方向。细胞DDR 处理DNA 病毒复制中间体结构的机制还有待结构生物学深入解析，对DNA 病毒复制性感染的影响程度还需要更深入研究。蛋白质组学技术可以鉴定DNA 病毒感染引起的宿主细胞DDR 信号网络蛋白质分子翻译后修饰的变化[67-70]，以及被病毒早期蛋白降解抑制的宿主细胞抗病毒蛋白的变化。随着现代生物技术的不断发展，DNA 病毒感染与细胞DDR 信号网络之间的互作分子机制会逐步被解开。

随着2003 年非典型肺炎和2019 年新冠肺炎的暴发，人兽共患病和公共卫生日益受到人类的重视。有关动物DNA 病毒感染与宿主细胞DDR 信号网络间的互作机制目前还有很多未解之谜。对动物DNA 病毒感染与宿主细胞DDR 信号网络之间互作的研究，可以为人类传染性疾病的防御和治疗提供参考，同时为利用溶瘤病毒治疗肿瘤的方法提供动物研究模型。