漆黄素脂质体的制备及其质量评价

王蓓蓓，姜亚莉，林郁，许颖

(1. 江苏大学药学院，江苏 镇江 212013； 2. 扬州大学附属医院药剂科，江苏 扬州 225001)

漆黄素是一种天然黄酮类化合物，又名非瑟酮。作为一种天然的黄酮类抗氧化剂，漆黄素广泛存在于漆木科植物木蜡树(Rhussuccedanea.L)、盐肤木(RhuschinensisMill．)等植物以及蔬菜、水果中。研究表明，漆黄素具有广泛的药理活性，包括抗炎抗氧化、抗抑郁[1]、降低胆固醇，对老年小鼠脑出血诱导的神经炎症[2]、对心肌缺血再灌注损伤[3]均具有一定的保护作用。此外，研究表明，漆黄素可能通过抑制由糖尿病诱导的p300表达以及促进MMP2的表达，从而发挥显著改善糖尿病大鼠肾脏病变的功效[4]。更重要的是，漆黄素还具有抑制多种癌细胞如HepG2 和Hela的增殖，诱导癌细胞凋亡的作用[5]。然而，漆黄素具有水溶性较差，不易被胃肠等生物膜吸收，半衰期较短，口服生物利用度低等缺点，其临床应用受到一定的限制。因此漆黄素新剂型的开发已经成为研究热点。

漆黄素作为一种天然产物，相关研究主要集中于药理活性方面，制剂的相关报道较少。目前，已报道的漆黄素制剂仅有环糊精包合物[6]，壳聚糖修饰的漆黄素聚乳酸纳米粒。脂质体是一种优良的药物载体，具有毒性低和生物相容性高等优点。此外，脂质体具有亲水性内核和疏水性磷脂双分子层，能够有效包载亲水和亲脂性药物，是最具前景的纳米给药系统之一。目前已有多种脂质体制剂用于临床。

为解决漆黄素溶解度低、口服吸收差的问题，本实验设计开发漆黄素脂质体，并对其理化性质进行评价，以期提高漆黄素的溶解度和生物利用度。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

漆黄素(98.58%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；胆固醇(98%)、胆酸钠(98%)购自上海阿拉丁试剂公司；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、大豆卵磷脂(98%)购自上海麦克林试剂公司；甲醇、乙腈(国药集团化学试剂有限公司)为色谱纯；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)为分析纯。

旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂)；恒温振荡器(太仓华利达有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent 1260 系列，美国安捷伦科技公司)；电子天平FA2004N(上海精密仪器有限公司)；Nano Brook 90 plus PALS分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)；TecnaiG2 F30 S-TWIN场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)。

1.2 实验动物

清洁级SD大鼠12只，雄性，标准体重(200± 20)g，由江苏大学实验动物中心提供。实验方案经过江苏大学实验动物伦理委员会审查。

1.3 漆黄素的定量分析方法的建立

1.3.1 漆黄素标准溶液的制备(建立体外标准曲线) 精密称取漆黄素对照品25 mg，加少量甲醇溶解，超声30 min后，移至250 mL的容量瓶，并用甲醇定容至刻度，得100 μg/mL 漆黄素储备液。精密量取漆黄素母液0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度分别为0.1、0.5、1、5 、10、20和50 μg/mL的漆黄素标准溶液。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇 ∶水=60 ∶40，流速：1 mL/min，检测波长：364 nm，柱温：25 ℃，进样量：20 μL。内标：异甘草素。

1.3.3 血浆样品的处理 取血浆样品 200 μL置于1.5 mL 的离心管中，加入内标溶液异甘草素 20 μL(50 μg/mL)，涡旋30 s混匀。加入乙酸乙酯 600 μL，漩涡 2 min，萃取2次，10 000 r/min离心10 min，合并萃取液，氮气吹干，用 100 μL流动相复溶，取20 μL进样检测。

1.4 脂质体的制备

采用薄膜分散法制备漆黄素脂质体。称取处方量的大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸钠和肉豆蔻酸异丙酯，加入无水乙醇溶解，超声使其充分溶解，再加入处方量的漆黄素，超声溶解后置于旋转蒸发仪上(50 r/min, 40 ℃)，减压除去无水乙醇，并获得均匀的脂质体薄膜。向其中加入适量双蒸水，置恒温振荡器中水化30 min，超声一定时间使脂质体分子分散后备用。

1.5 单因素考察

以粒径为指标，按照“1.4”项下方法，制备不同磷脂与胆固醇总量(100、150、200 mg)，不同磷脂胆固醇比例(5 ∶1、8 ∶1、11 ∶1)及不同药脂比(1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7)的漆黄素脂质体，以粒径为指标，对脂质体进行处方优化。

1.6 粒径、电位测定及形态观察

脂质体用双蒸水稀释10倍，采用激光散射粒径仪测定脂质体的粒径、多分散系数以及Zeta电位。对漆黄素脂质体进行负染，采用场发射透射电子显微镜观察漆黄素脂质体的形态。

1.7 包封率与载药量的测定

采用超滤离心法测定漆黄素脂质体的包封率。精密移取0.5 mL漆黄素脂质体，置于超滤离心管(截留分子量8 000)中，12 000 r/min离心20 min。取超滤膜上的样品及滤膜下的滤液分别置于2个容量瓶中，用色谱甲醇破乳定容后，HPLC法测定浓度，分别记为C1，C2，按如下公式计算漆黄素脂质体的包封率：包封率=C1/(C1+C2)×100%。处方中加入的药物量记为W1，加入的总的辅料的量记为W2，如下公式计算漆黄素脂质体的载药量：载药量=(包封率×W1)/(W1+W2)×100%。

1.8 漆黄素脂质体初步稳定性试验

精密称取一定量漆黄素脂质体，密封于棕色玻璃瓶中，分别置于4 ℃， 25 ℃， 60 ℃恒温干燥器中放置30 d，于第 0、15、30天取出，测定粒径变化。

1.9 体外释放考察

采用透析法考察漆黄素脂质体在pH 1.2 盐酸、双蒸水和pH 7.4 磷酸盐缓冲液3种释放介质中的体外释放情况。分别取漆黄素溶液、漆黄素脂质体1 mL(含漆黄素1 mg)置于透析袋中，两端扎紧，放入100 mL 不同的释放介质中，(37.0±0.5) ℃，转速为 100 r/min，分别在0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h取样 1 mL，并及时补充同等体积同温度的释放介质。取出的样品10 000 r/min离心后，取上清液，采用HPLC法测定释放液中游离漆黄素的浓度，计算出漆黄素的累积百分释放率，绘制累积释放曲线。

1.10 药物动力学实验

健康雄性SD大鼠10只随机分为两组，每组5只，分别以50 mg/kg的剂量灌胃给予漆黄素混悬液和漆黄素脂质体。给药前12 h禁食不禁水，分别在给药后 0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h于大鼠眼眶静脉丛取血，3 700 r/min离心10 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存备用。血样处理方法参照“1.3.3”方法。

漆黄素和漆黄素脂质体的血药浓度-时间曲线采用BAPP 2.3软件进行拟合，得到相关药代动力学参数。Cmax为给药后的最大血药浓度，Tmax为给药后血药浓度达峰时间，t1/2为末端消除半衰期，T1/2为药物在大鼠体内的半衰期，AUC(0-24 h)为血药浓度-时间曲线下面积。

1.11 漆黄素体外抗肿瘤实验

将HepG2细胞接种于96孔板中，每孔1×105个细胞，每孔100 μL培养基(含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)于37 ℃培养箱5% CO2下培养细胞贴壁生长24 h后，用不同浓度(0.5、1、2、5、10、25、50、100 μg/mL)的漆黄素原料药，漆黄素脂质体，空白脂质体(阴性对照)和5-Fu(阳性对照)处理72 h。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，加入100 μL DMSO，于490 nm采用酶标仪测定光密度。

1.12 统计学方法

2 结果

2.1 方法学考察

按照“1.3.2”及“1.3.3”项下色谱条件和样品处理方法，漆黄素、空白血浆+漆黄素+内标的HPLC色谱图如图1所示，表明分析方法具有良好的专属性。

A：漆黄素；B：空白血浆+漆黄素+内标

标准曲线结果：以浓度(C)对峰面积(Y)进行回归，得体外样品测定标准曲线Y=19.211 3C+2.083 1，R2=0.9991，体内样品测定的标准曲线为Y=0.3612C-0.1026,R2=0.9978。漆黄素体内外样品测定的线性范围均为0.1～100 μg/mL, 相对标准偏差(RSD)<2%(n=6)，日内、日间精密度，方法回收率和重复性均符合方法学要求。

2.2 单因素考察

磷脂与胆固醇的总量为150 mg时，脂质体的粒径最小，因此选择150 mg为磷脂与胆固醇的总量。当磷脂与胆固醇的比例为8 ∶1时，脂质体粒径最小，因此磷脂与胆固醇的比例确定为8 ∶1。药物与磷脂比为1 ∶6及1 ∶7时，漆黄素脂质体的粒径差别不大，因此选择药脂比为1 ∶6。胆酸钠用量与脂质体粒径成负相关，胆酸钠用量为110 mg时，漆黄素脂质体的粒径最小，因此，选择胆酸钠用量为110 mg。见图2。由此，通过单因素实验得到最优处方为漆黄素22.2 mg、磷脂133.3 mg、胆固醇16.7 mg、胆酸钠110 mg、肉豆蔻酸异丙酯60 mg。

图2 漆黄素脂质体单因素处方筛选实验

2.3 体外表征

粒子粒径分布图及形貌观察结果如图3所示。粒径、电位测定结果显示，漆黄素脂质体的粒径为(60.32±1.08) nm，多分散系数为0.198±0.011，电位为(-31.34±1.45) mV。由透射电镜图可知，漆黄素脂质体粒子外形圆整，呈现为类球形，与粒径分布仪所测结果一致。漆黄素脂质体包封率为(94.37±0.62)%，载药量为(4.500±0.021) %。

A：漆黄素脂质体粒径分布图；B：漆黄素脂质体透射电镜图

2.4 稳定性考察

不同温度条件下漆黄素脂质体粒径30 d内变化较小(表1)，表明所制备的漆黄素脂质体30 d内稳定性良好。

表1 漆黄素脂质体在4 ℃、25 ℃、60 ℃下的初步稳定性考察

2.5 体外释放

在3种介质(pH1.2 盐酸、双蒸水、pH7.4 磷酸盐缓冲液)中，漆黄素的累积释放率均低于50 %，而漆黄素脂质体的累积释放率均高于70 %，漆黄素脂质体的累积释放率均高于游离漆黄素。此外可以观察到，漆黄素脂质体在pH1.2盐酸水溶液中的累积释放率均高于其在pH 7.4磷酸盐缓冲液和双蒸水中的累积释放率。见图4。

图4 漆黄素原料药及漆黄素脂质体在不同介质中的体外释放

2.6 药物动力学结果

漆黄素脂质体在大鼠体内各时间点的血药浓度均高于漆黄素原料药(图5)。漆黄素原料药的AUC(0-12 h)为(6.29±0.35) μg/(mL·h)，而漆黄素脂质体为(20.28±0.66) μg/(mL·h)，是漆黄素原料药的3.22倍，具有显著性差异(P<0.01)，见表2。同时，漆黄素脂质体的T1/2为(3.79±0.12) h，相比于漆黄素原料药的(1.91±0.09) h，半衰期延长了1.88 h(约1倍)，具有显著性差异(P<0.01)。因此，将漆黄素包裹于脂质体中，能有效延长漆黄素的半衰期，增加其生物利用度。

图5 漆黄素和漆黄素脂质体的血药浓度-时间曲线

表2 SD大鼠尾静脉注射漆黄素和漆黄素脂质体的主要药动学参数

2.7 抗肿瘤活性评价

MTT实验结果显示，阳性对照和漆黄素脂质体组的抑制率在各浓度水平均显著高于漆黄素原料药组。漆黄素原料药和漆黄素脂质体对HepG2细胞均有抑制作用，且呈现为剂量依赖关系，随着给药浓度增加，HepG2细胞的抑制率增加。见图6。

*：P<0.05，与漆黄素原料药组比较

3 讨论

漆黄素具有多种药理活性，但因高亲脂性和低水溶性致使口服生物利用度低，限制了其在临床上的应用和发展[7]。为了克服这些问题，基于脂质体的药物传递系统具有良好的市场前景。作为一种性质优良的药物递送系统，包括氯膦酸二钠等在内的多种药物均被制备成脂质体[8-9]。此外，脂质体已被证明可以使药物具有很高的肿瘤蓄积性，这种肿瘤保留作用是由于脂质体药物可以通过肿瘤的多孔毛细血管内皮渗透[10]。目前在临床上已经有几种脂质体形式的蒽环类药物，这些制剂有助于降低毒性，同时又保持它们在乳腺癌和软组织癌中的抗癌活性[10-11]。

本实验制备的漆黄素脂质体具有合适的粒径(60.32±1.08)nm，较窄的粒径分布0.198±0.011和高达94.37 %的包封率。较小的粒径有助于提高脂质体粒子穿透血管膜，进入组织脏器从而发挥作用[12]。本实验制备的漆黄素脂质体Zeta电位为(-31.34±1.45) mV，较高的电位意味着脂质体具备更好的稳定性，原因在于脂质体粒子之间的斥力较强，不易沉积。

本实验中，漆黄素脂质体能够提高漆黄素的溶解度，改善漆黄素的体外释放行为。在pH 1.2盐酸条件下的累积释放率均高于其在pH 7.4磷酸盐缓冲液和双蒸水中的累积释放率。这与Pawar等[7]的研究结果类似。这是由于漆黄素在酸性pH下的溶解度更高，这会增加其在癌细胞中的选择性吸收以及靶向吸收的优势。因为在癌细胞中，pH值比正常生理pH值略偏酸性。

药动学拟合结果表明漆黄素脂质体能延长漆黄素在体内的滞留时间，可能是由于更快的吸收以及逃避了巨噬细胞的吞噬从而延长了在体内的停留时间。脂质体可以通过以下几种方式来影响药物吸收：① 通过增强药物在肠道环境中的溶解性；② 基于肠细胞的运输和代谢过程相互作用，从而可能改变药物的吸收、外排、转运和肠细胞内代谢产物的形成；③ 通过改变药物转运到体循环的途径(门静脉和肠淋巴系统)，这反过来可以减少药物代谢的首过效应，因为肠淋巴系统不经过肝脏而直接进入体循环，从而可以达到降低给药剂量以及毒副作用的效果。脂质体是一种良好的提高生物利用度的药物递送系统[13]，粒子的大小会直接影响其稳定性、药物释放、生物分布和细胞摄取。因为大于10 nm的纳米颗粒可以逃避肾脏的清除，而小于200 nm的纳米颗粒可以逃避巨噬细胞的吞噬，延长了其循环半衰期，也更有利于通过EPR效应被动靶向实体肿瘤。此外，在脂质体的脂质双膜中添加胆酸钠可使其与肠上皮接触时发挥膜破坏作用，从而促进药物从脂质体中释放，潜在地提高了药物的口服生物利用度[14]。

本研究结果表明，漆黄素原料药和漆黄素脂质体对于HepG2细胞均有抑制作用，且呈现为剂量依赖关系，随着给药浓度增加，HepG2细胞的抑制率增加。相关研究表明，漆黄素通过调控多种信号通路实现抗HepG2 细胞的增殖作用[15]，其通过降低Bcl2的表达，并降低Bax、caspase-3和多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的水平，从而诱导HepG2细胞凋亡和细胞坏死。且经过脂质体的有效包封，漆黄素对HepG2的抑制效果得到显著增强。其抑制作用的增强可能是由于肿瘤细胞内皮屏障的异常有利于脂质体在肿瘤组织中内渗，在脂质体膜与细胞膜相互作用中，漆黄素迅速释放、进入细胞，导致漆黄素在肿瘤细胞内的浓度增加[16]。此外，在酸性环境中，漆黄素具有较好的溶解度，能增加药物的释放，有助于提高漆黄素脂质体作为高效药物递送系统的效率。因此，肿瘤细胞所处的弱酸性环境可以触发漆黄素从漆黄素脂质体中快速释放，从而大大增强其细胞毒性，并降低其对正常细胞的影响。

综上所述，本实验通过优化制备的漆黄素脂质体具有较好的理化性质，可有效提高难溶性药物漆黄素的溶解度及生物利用度，且体外实验证实其对HepG2细胞具有明显的抑制作用。本研究结果为漆黄素的临床应用提供了参考，并为难溶性药物的增溶提供借鉴。