普洱茶及茶粉中茶褐素含量测定的研究

胡圆圆，杨云忠，王 萍，李绍仙，李 艳，车 涛

（普洱市质量技术监督综合检测中心，云南普洱 665000）

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶[1]。它品性温和，独具陈香、醇厚、甘滑的韵味。由于普洱茶具有“越陈越香”的特点，有人称为“可以喝的古董”[2]。普洱茶汤中独特的口味和色泽越来越受现代人的青睐，它当中的主要成分是“茶褐素”。

茶褐素是指茶叶中以儿茶素为主的多酚类化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素，是一类易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇及三氯甲烷等有机溶剂的高聚合物质[3]。其化学组成主要由含多苯环的褐色色素、多糖残基、蛋白残基、咖啡碱以及脂类物质组成，主要的功能性基团为羧基、羟基、氨基以及甲基等基团，具有酚类物质特性。其主要形成途径认为是有多酚氧化形成的茶红素、茶黄素与蛋白质、多糖、咖啡碱及脂类物质在微生物分泌酶的酶促作用、微生物“呼吸热”以及湿热作用下通过氧化聚合、偶联聚合等方式形成，一部分可溶入茶汤，一部分则残留于叶底。茶褐素具有减肥、调节血脂、抗动脉粥样硬化和抗氧化等作用，是普洱茶的主要活性物质[4-6]。

因此能准确测定普洱茶中茶褐素的含量对推动普洱茶产业发展起推动作用，但传统的检测方法对测定结果的不稳定性。本文参考杨妍等[7]方法进行了一系列相关的验证试验，均得到准确的测定结果。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

普洱茶叶与茶粉由云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供；无水乙醇（天津市化学试剂三厂）；蒸馏水：符合《分析实验室用水规格和试验方法》。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（TU-1810SPC，北京普析通用仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（R-215，瑞士）；高速冷冻离心机（GL-12B，上海安亭科学仪器厂）；万分之一分析天平(ME614S，Sartorius)；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；抽滤泵（台州市黄岩汇丰真空设备）。

1.3 实验方法

1.3.1 茶褐素标准品的制备

精确选取优质茶样30个，在电子天平上称重，每个茶样称取100 g。将称好的茶样进行充分混匀，按料液比为1∶10的比例加入沸水，保温浸提两次，每次30 min，得茶汤，用滤布过虑茶汤，得到澄清的汤液，对过滤后的茶汤进行真空减压浓缩，然后对浓缩液进行离心。向离心后的茶汤浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量为总量的80%，静置6 h，离心得沉淀。得到该沉淀即为茶褐素标准品，在60 ℃条件下烘干，为制作标准曲线做准备。取50 g以上得到的茶褐素沉淀（即标准品），加入1 000 mL蒸馏水充分搅拌，使其全部溶解。对溶解进行分级，使用＞50 000 Da的滤膜，分级后依次得到物质，并进行冷冻干燥得到干物质。然后以＞50 000 Da的茶褐素作为标准品。

1.3.2 供试品溶液的制备

（1）普洱茶叶溶液的制备。准确称取3.00 g茶样，加入沸水（蒸馏水）150 mL，摇匀后在沸水浴中浸提10 min，收集茶汤（浸提中摇瓶1次），取出摇匀，趁热用滤纸过滤于三角瓶中，冷却至室温。将滤液倒入烧杯，加入无水乙醇至乙醇含量为80%，静置5 h后进行离心（4 500 r/min，10 min）后得沉淀。向沉淀中加入100 mL蒸馏水，溶解，吸取溶液1 L放入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL。此溶液作为供试品溶液。

（2）普洱茶粉溶液的制备。直接称取茶粉样品（约0.500 0 g）溶解于100 mL蒸馏水中，吸取1 mL滤液放入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL。此溶液作为供试品溶液（＞50 000 Da）。

1.3.3 茶褐素标准曲线的绘制

准确称取0.025 0 g（＞50 000 Da）的标准品，加蒸馏水溶解，定容至250 mL（c=0.1 mg/mL）。分别取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL和10.0 mL标准品于11支试管，分别加蒸馏水补至10 mL，静置。分别在270 nm波长下比色（0 mL试管作空白），以浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程：y=9.489 3x-0.003 8。

1.3.4 普洱茶及茶粉样品的测定

将供试品溶液，用紫外分光光度计在270 nm波长下，用1 cm厚的石英比色皿，蒸馏水为空白，测定溶液的吸光度。每个样品重复测定3次，每次做3个平行。普洱茶及茶粉中茶褐素含量的测定按下列公式计算：

式中：A为270 nm下测定的吸光值；n为稀释倍数；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

精密称取0.025 0 g＞50 000 Da茶褐素标准品，加蒸馏水溶解，定容至250 mL。标准品浓度为（c=0.1 mg/mL）。分别取0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL及10.0 mL标准品于11支试管，分别加蒸馏水补至10 mL，静置。分别在270 nm波长下比色（0 mL试管作空白），以浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程：A=10.024 1C+0.000 1，见图1。

图1 茶褐素的标准曲线

2.2 精密度实验

取同一批号的样品约0.5 g，按照供试品溶液的制备方法操作，按供试品溶液的测定方法，于270 nm处连续测定吸光度6次。普洱茶RSD值为0.50%，茶粉RSD值为0.42%，结果见表1。

表1 精密度试验结果

2.3 重复性实验

取同一批号的样品，共计6份，按照供试品溶液制备方法操作，按供试品溶液的测定方法，于270 nm处连续测定吸光度。茶粉标准偏差RSD为0.51%，普洱茶（熟茶）RSD为0.54%结果稳定，见表2和表3。

表2 茶粉的重复性试验结果

表3 普洱茶（熟茶）的重复性试验结果

2.4 稳定性试验

取同一批号的样品，称样量5.005 g，按照供试品溶液制备方法操作，按供试品溶液的测定方法，在0 h、2 h、4 h、 6h、8 h、10 h及12 h于270 nm处测定起吸光度。当时间放置在6 h以上时，吸光值趋于稳定，见表4。

表4 稳定性试验结果

2.5 回收率实验

取同一批号样品，共计6份，按照供试品溶液制备方法操作，加入茶褐素标品，进行加标回收实验，按供试品溶液的测定方法，于270 nm处连续测定吸光度，计算茶褐素含量，结果见下表5和表6。通过表5和表6，茶粉的回收率在96.0%～98.0%，普洱茶（熟茶）回收率在96.0%～98.0%。回收率实验效果好，有利于对样品的测定。

表5 茶粉回收率试验结果

表6 普洱茶（熟茶）回收率试验结果

3 讨论

通过对该方法一系列的验证，可以得出该检测方法具有较好的线性范围、较高的精密度、良好的稳定性和重复性及较高的回收率。本方法通过根据标准品来测定茶褐素，方法简单、易行，操作简便，测定结果稳定更接近真实值，准确可信，适用于茶叶及茶制品中茶褐素的测定。