有氧运动抑制NLRP3炎性小体活化减轻2型糖尿病小鼠肾脏损伤

2021-02-13周中源史媛媛王梦项洁

中国运动医学杂志 2021年12期

周中源史媛媛王梦项洁

1 徐州医科大学（徐州221000）

2 徐州医科大学附属医院康复科（徐州221000）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是指由糖尿病引起的慢性肾脏疾病，主要特征为临床持续性白蛋白尿和/或肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）进行性下降，是最严重的糖尿病并发症之一，也是世界范围内终末期肾病（end-stage renal dis⁃ease，ESRD）的主要危险因素[1]。DKD 发病机理复杂，有遗传和环境等多种因素参与，既往研究认为糖代谢异常和血流动力学紊乱是糖尿病肾损伤的重要原因。近些年来，炎症反应在糖尿病肾病中的作用广受关注[2，3]。

炎性小体是机体固有免疫的重要组成部分，是炎症反应的重要媒介。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide binding and oligomerization do⁃main- like receptor family pyrin domain- containing protein 3，NLRP3）是目前研究最深入的一种炎性小体，它是多种蛋白质组成的复合体，主要由NLRP3 蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a CARD，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific pro⁃teinase 1，Caspase-1）组成[4]。NLRP3炎症小体能够被多种危险信号激活，促进白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-18（interleukin-18，IL-18）等多种炎性因子的成熟和分泌，参与炎症级联反应。NLRP3 炎性小体在自身炎症性疾病[5]、阿尔茨海默病[6]、动脉粥样硬化[7]、炎症性肠病[8]、2型糖尿病[9]等多种疾病过程中起关键作用。研究发现，高糖刺激下，NLRP3 炎症小体活化，引起Caspase-1表达升高，触发下游炎症级联反应，导致足细胞损伤[10]。Gao等[11]发现，抑制NLRP3炎症小体活化减少足细胞损伤，明显改善糖尿病肾病中肾脏的组织损伤。在STZ 诱导的糖尿病小鼠中，NLRP3 敲除可改善肾功能损伤，减轻肾小球硬化、系膜扩张、间质纤维化及炎症因子的表达[12]。这表明，NLRP3 炎性小体介导的慢性炎症反应在DKD 进展中扮演重要角色。

目前，我国的糖尿病肾病治疗现状不容乐观，亚洲糖尿病联合评估模式（Joint Asia Diabetes Evalua⁃tion，JADE）研究结果显示，我国DKD患者相关指标综合达标率仅为3.6%[13]。常规的药物治疗疗效有限，中晚期更是收效甚微，以生活方式干预为基础的早期管理对于DKD 的治疗尤为重要。虽然运动训练对心血管疾病的益处已经确定，但运动训练对DKD 影响的基础研究较少，运动对糖尿病肾病小鼠肾组织中NLRP3炎性小体的影响更是鲜有报道。基于此，本研究通过对db/db小鼠进行8周中等强度跑台有氧训练，观察有氧运动干预对糖尿病小鼠肾组织中NLRP3炎性小体活化的影响，分析运动改善糖尿病肾病的作用机制，为糖尿病肾病的运动防治提供更多的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

20 只雄性7～8 周龄db/db（C57BLKS/J-leprdb/leprdb）小鼠，10只雄性7～8周龄db/m（C57BLKS/J-leprdb/+）小鼠购自南京大学-南京生物医药研究院，饲养于徐州医科大学实验动物中心SPF 级动物房（室温22℃～25℃，湿度40%～50%，12 h 光照/12 h 黑暗周期交替），通风良好，自由饮水进食。将20只8周龄雄性db/db小鼠随机分为糖尿病肾病模型组（DC组，n=10）和有氧运动干预组（DE 组，n=10），10 只8 周龄雄性db/m 小鼠作为正常对照组（NC组，n=10）。

1.2 运动训练方案

DE 组db/db 小鼠运动训练参照Moien-Afshari 等[14]研究方法进行跑台有氧运动训练。运动训练前3 天，小鼠进行跑台适应性训练：跑台坡度0°，速度5.2 m/min，运动时间从30 min逐渐增加至1 h。正式运动训练：坡度0°，速度5.2 m/min，每天1 次，每次1 h，每周连续5 天，持续8 周。NC 组与DC 组小鼠正常饲养，不进行运动训练。每日更换垫料，观察各组小鼠的营养状况、体质状况以及精神活动状态。

1.3 主要试剂和仪器

1.4 标本收集

运动干预8周后，小鼠处死前称重，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，腹主动脉取血，高速离心取上层血清，－20℃保存。迅速剥离双侧肾脏，生理盐水冲洗，用滤纸吸干肾表面液体后称重。右肾液氮冷冻后，－80℃保存，用于总超氧化物歧化酶活性、丙二醛水平测定及Western blot 相关蛋白检测；左肾4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm 切片，染色，用于光镜下肾组织病理形态观察。

1.5 观察指标及测定

1.5.1 体重、空腹血糖和尿微量白蛋白指标测定

在运动干预前、运动干预第4周和运动干预第8周末，提前一天将各组小鼠分别置于代谢笼，12小时后禁食不禁水，并于次日上午08:00～10:00，使用电子精密分析天平和便携式血糖仪测定小鼠体重和空腹腹血糖并记录，同时收集小鼠24小时尿样。将留取的尿液进行4000 rpm 4℃离心10 min，提取上清液至离心管并作标记，迅速置入－80℃冰箱冻存待测，用ELISA 法测定各组实验小鼠尿微量白蛋白。

1.5.2 血肌酐、血尿素氮和双肾质量指标测定

收集完尿量后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，打开胸腔腹腔，微量采血吸管刺破腹主动脉取血，室温静置2 小时后高速离心取上清，使用全自动生化仪采用酶法测定血肌酐和血尿素氮水平。迅速剥离小鼠双肾，生理盐水冲洗，滤纸吸干后，电子精密分析天平测量双肾质量。

1.5.3 肾脏组织总超氧化物歧化酶活性和丙二醛指标测定

取各组小鼠冻存于液氮中的肾脏组织6 mg，研磨后匀浆器充分匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活力，同样，通过硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛水平。

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1.5.4 肾脏病理形态学观察

左肾经4%多聚甲醛固定48 小时，流水冲洗24 小时，依次进行脱蜡、脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，制成4 μm 石蜡切片。部分进行HE 染色，光镜观察肾组织形态变化。部分切片进行PAS染色，步骤如下：切片脱蜡至水，氧化剂处理8 分钟，流水冲洗5 分钟，滴加Schiff 染液染色15 分钟，流水冲洗5 分钟，苏木素复染10 分钟，分化、水洗、脱水及环保封片剂封片。每只小鼠切片随机选取光镜下3 个视野的肾小球，对肾小球系膜扩张指数进行0～5分评分，评分标准[15]如下：0分为正常肾小球；1 分代表系膜基质增生占肾小球面积＜10%；2 分代表占比10%～20%；3 分代表占比20%～30%；4 分代表占比30%～40%；5 分代表占比＞40%。计算每张切片得分均值，记为肾小球系膜扩张指数评分。

1.5.5 Western blot检测相关蛋白表达

将小鼠肾组织从－80℃冰箱中取出，迅速称量40 mg左右肾皮质，剪刀剪碎，置于0.3 ml蛋白裂解液（RI⁃PA 强）和蛋白抑制剂（PMSF）混合液中，其中RIPA 强：PMSF=100∶1，充分进行匀浆，裂解后在4℃、14000 rpm/min 的条件下离心20 min，吸取上清液，使用BCA法测定蛋白质浓度，按比例加入5×蛋白上样缓冲液混合，水浴锅内100℃煮沸15 min 使蛋白变性，采用8%、12.5% SDS-PAGE 进行凝胶电泳。蛋白上样量为40 μg，80 V 恒压电泳跑至分离胶蛋白Marker 分开后，上调电压至135 V，样品跑至适当距离后关闭电源；330 mA 恒流湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜（NC 膜）上，无蛋白快速封闭液封闭15 min，TBST清洗后加入一抗NLRP3（1∶1000）、ASC（1∶1000）、Caspase1/P20/P10（1∶1500）、IL-1β（1∶1500）、IL-18（1∶1500）、NOX4（1∶1000）、NPHS2（1∶1000）和β-Actin（1∶1500），4℃摇床过夜，TBST 清洗，室温下荧光二抗孵育2 h，再次TBST清洗后置于Odyssey CLx近红外双色荧光成像系统仪中扫描检测；采用Image J 软件分析图片，记录各组蛋白条带灰度值，将Caspase1和IL-1β蛋白的剪切体蛋白条带灰度值与相应蛋白前体（Pro-）的条带灰度值的比值均值进行组间比较，其余以目的蛋白条带灰度值与β-Actin条带灰度值的比值均值进行组间比较。

1.6 统计学分析

使用SPSS 23.0统计软件进行分析，实验数据采用平均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，使用Graphpad prism 9.0作图，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体重、空腹血糖和24 小时尿微量白蛋白比较

从表1中可以看出，DC和DE组小鼠体重显著高于NC 组（P＜0.01）。与DC 组相比，DE 组小鼠在运动干预第4 周体重略有下降，但无统计学意义（P＞0.05）；运动干预第8 周，DE 组小鼠体重显著低于DC 组（P＜0.01）。检测各组小鼠空腹血糖发现，DC 和DE 组小鼠的空腹血糖水平显著高于NC组（P＜0.01）；与DC组小鼠相比，DE组小鼠空腹血糖无明显变化（P＞0.05）。与NC组相比，DC 和DE 组小鼠24 小时尿微量白蛋白显著升高（P＜0.01）；8周的运动干预后，与DC组相比，DE组小鼠24小时尿微量白蛋白显著降低（P＜0.01）。

表1 各组小鼠体重、空腹血糖和24小时尿微量白蛋白比较（n=10）

2.2 各组小鼠双肾质量、血尿素氮和血肌酐比较

从表2可以看出，DC和DE组小鼠双肾质量显著高于NC 组小鼠（P＜0.01）；与DC 组相比，8 周运动干预后DE 组小鼠双肾质量显著下降（P＜0.05）。与NC 组相比，DC 和DE 组小鼠血肌酐和血尿素氮水平显著升高（P＜0.01）；DE 组小鼠较DC 组小鼠血肌酐和血尿素氮水平显著下降（P＜0.05），说明有氧运动干预显著改善糖尿病小鼠肾功能。

表2 各组小鼠双肾质量、血肌酐和血尿素氮比较（n=10）

2.3 各组小鼠肾组织总超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平比较

从表3 可以看出，与NC 组相比，DC 组小鼠肾组织中总超氧化物歧化酶活性显著降低（P＜0.01），丙二醛含量显著升高（P＜0.01）；与DC组相比，DE组小鼠肾组织中总超氧化物歧化酶活性显著升高（P＜0.01），丙二醛的含量则显著下降（P＜0.01），说明有氧运动干预显著降低糖尿病小鼠肾脏氧化应激水平。

表3 各组小鼠肾组织总超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平比较（n=10）

2.4 各组小鼠肾组织病理形态表现

HE染色结果显示：NC组小鼠肾组织形态正常，肾小球与肾小管形态规则，无炎症细胞浸润。与NC组相比，DC 组小鼠可见肾小球体积明显增大，伴有不同程度肾小管水肿扩张，肾小管上皮细胞空泡变性，肾间质局部炎性细胞浸润明显。DE组小鼠肾小球轻度增大，肾小管扩张减轻，病变程度明显轻于DC 组，详见图1A。

PAS 染色结果显示：NC 组小鼠肾组织形态结构正常，DC 组小鼠肾小球基底膜明显增厚，系膜基质弥漫性增多。DE组小鼠病变程度较轻，详见图1A。

根据PAS染色对各组小鼠进行肾小球系膜扩张指数评分，结果显示：与NC 组相比，DC 组小鼠肾小球系膜扩张指数评分显著升高（P＜0.01）；与DC 组相比，DE组小鼠肾小球系膜扩张指数评分显著降低（P＜0.05）。见图1B。

图1 各组小鼠肾组织病理形态表现（HE，×400；PAS，×400）

2.5 各组小鼠肾组织中肾组织内NLRP3、ASC、Cas⁃pase1、IL-1β、IL-18、NOX4 和NPHS2 蛋白的表达水平比较

Western blot 结果显示：与NC 组相比，DC 组小鼠肾皮质中，炎性小体活化成分NLRP3、ASC 和Caspase1蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与DC组相比，DE组小鼠肾皮质中NLRP3、ASC 和Caspase1 蛋白表达显著降低（P＜0.01），详见图2A、2B。与NC 组相比，DC 组小鼠肾皮质中，与NLRP3 炎性小体相关的炎症因子IL-1β和IL-18 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与DC 组相比，DE组小鼠肾皮质中IL-1β和IL-18蛋白表达显著降低（P＜0.01）。与NC 组相比，DC 组小鼠肾皮质中氧化应激相关蛋白NOX4 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与DC 组相比，DE 组小鼠肾皮质中NOX4 蛋白表达显著降低（P＜0.01）。此外，与NC组相比，DC组小鼠肾皮质中足细胞标志蛋白NPHS2蛋白含量显著降低（P＜0.01）；DE组小鼠较DC 组小鼠肾皮质中NPHS2 蛋白含量显著升高（P＜0.01）。详见图2C、2D。

图2 各组小鼠肾组织NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、IL-18、NOX4和NPHS2蛋白表达变化

3 讨论

3.1 糖尿病肾病小鼠模型的选择与分析

近些年来，随着糖尿病患病率迅速上升，并呈现年轻化趋势，DKD 患者数量也急剧增加。流行病学调查显示，我国DKD 患者估计高达2430 万，DKD 已经超过肾小球肾炎相关肾病，成为慢性肾脏病（chronic kid⁃ney disease，CKD）的首要病因[16]。糖尿病肾病动物模型是研究糖尿病肾病发病机制及其新的干预措施的重要保障。传统的方法是采用腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）的方法，构建糖尿病肾病小鼠模型，但是该方法成模率低、死亡率高、稳定性差。db/db小鼠是位于4 号染色体上Leptin 受体基因缺陷导致的自发性2 型糖尿病小鼠，具有明显的肥胖、高血糖、糖尿、蛋白尿、肾小球肥大等特点，与人类糖尿病肾病发病过程和病理特征相似，是研究糖尿病肾病的理想动物模型。

3.2 中等强度跑台运动对糖尿病肾病小鼠体重、血糖、肾功能及肾脏形态学的影响

本研究发现，糖尿病肾病小鼠较正常对照组小鼠相比，出现明显肥胖，高血糖和尿微量白蛋白增高现象，与Cohen等[17]的研究结果一致。虽然8周有氧运动干预后，运动干预组小鼠较糖尿病肾病小鼠体重明显降低，但运动干预对糖尿病肾病小鼠空腹血糖水平变化无明显影响，这可能是因为db/db小鼠本身就是持续高血糖的状态，本研究运动方案的强度和持续时间不足以影响db/db 小鼠血糖水平。Moien-Afshari 等[14]研究同样发现，有氧运动可以改善db/db小鼠心脏冠脉血管功能，但是并没有改善胰岛功能和血糖水平。8周有氧运动干预还明显降低了糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白、血肌酐和血尿素氮水平，对糖尿病肾病小鼠肾功能改善作用明显。

双肾质量是反映肾脏组织肥大的重要指标，多项研究表明[18-20]，糖尿病肾病小鼠双肾质量大于同龄的正常对照组小鼠，本研究结果与前人研究一致。本研究还发现，8 周中等强度跑台动运后，运动干预组小鼠双肾质量较糖尿病肾病小鼠明显减轻。

肾小球体积变大，肾小管水肿扩张，肾小球基底膜增厚，系膜基质增生扩张和肾间质炎性细胞浸润是糖尿病肾病典型的病理特征。Cohen等[18]研究发现，db/db小鼠在8～9周龄肾组织即出现明显系膜基质增生扩张的病理形态。Bilous等[21]的研究同样证实，在糖尿病肾病大鼠模型中，肾组织病理形态主要表现为肾小球基底膜增厚和系膜基质增生扩张。本研究结果显示，8周有氧运动干预可明显减少糖尿病肾病小鼠肾组织系膜基质增生扩张，使肾小球体积变小，肾小管水肿减轻和肾间质炎性细胞浸润减少。以上研究结果表明，8周中等强度跑台有氧运动能够降低糖尿病肾病小鼠体重，改善其肾功能和减轻肾脏病理形态变化。

3.3 中等强度跑台运动对糖尿病肾病小鼠肾组织内NLRP3、ASC、Caspase1、IL-1β、IL-18、NOX4 和NPHS2蛋白表达的影响

NLRP3 炎性小体不仅存在于免疫细胞中，还存在于肾脏固有细胞中，NLRP3 炎性小体的激活在糖尿病肾病发生发展中起重要作用[22-24]。Lee 等[9]研究发现，NLRP3炎性小体在2型糖尿病患者体内高表达。体外细胞实验也证实[25-27]，高浓度葡萄糖刺激肾小球系膜上皮细胞、足细胞和人肾小管上皮细胞（human kidney 2，HK-2）时，均发现NLRP3 蛋白表达增加，细胞凋亡明显增多。本研究同样证实，糖尿病肾病小鼠肾组织中NLRP3蛋白表达明显高于正常对照组小鼠。

本研究进一步证实，8周有氧运动显著改善了糖尿病肾病小鼠肾功能，并且有氧运动对肾脏的保护效应与NLRP3 炎性小体密切相关，那么其作用具体机制如何？张子怡等[28]研究发现，4周低氧复合运动明显抑制低氧诱导的骨骼肌NLRP3 炎性小体活化，进而抑制炎性损伤。Wang 等[29]研究发现，4 周有氧耐力训练显著抑制抑郁症模型小鼠海马组织NLRP3 炎性小体活化。此外，Yang等[30]研究显示，有氧运动明显抑制NLRP3炎性小体激活，改善非酒精性脂肪性肝炎。以上研究表明，在不同组织中，有氧运动都能够抑制NLRP3炎性小体激活，减轻局部组织炎性反应。目前，尚无关于有氧运动对糖尿病肾病小鼠肾组织中NLRP3炎性小体相关信号通路蛋白影响的研究报道，本研究发现，与正常对照组小鼠相比，糖尿病肾病小鼠肾组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18 蛋白水平均显著升高，8 周中等强度有氧运动明显抑制了糖尿病肾病小鼠肾组织中NLRP3 炎性小体通路相关蛋白表达。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是NLRP3 炎性小体激活的常见危险因素[31]。我们推测，长期高血糖可能促进了糖尿病肾脏组织氧化应激反应，进一步激活了NL⁃RP3炎性小体，引起肾脏细胞凋亡，进而导致了肾脏损伤。本研究证实，与正常对照组小鼠相比，糖尿病肾病小鼠肾组织中氧化终产物丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶活力明显降低，NOX4 蛋白表达升高，NPHS2 表达降低，说明糖尿病肾病组小鼠肾组织内氧化应激水平较高，且肾小球基底膜滤过屏障明显受损。Eid等[32]研究结果也表明，高糖可以上调足细胞NOX4 蛋白高表达，促进ROS 产生，诱导足细胞凋亡。8周中等强度跑台有氧运动明显抑制了糖尿病肾病小鼠肾皮质中NOX4 蛋白表达，降低了氧化终产物丙二醛水平，促进超氧化物歧化酶活力升高，促进NPHS2 蛋白表达水平升高，这表明有氧运动可能抑制糖尿病肾组织中氧化应激反应，进而抑制NLRP3炎性小体激活，减少炎症因子释放，减轻糖尿病肾病肾损伤。由此可见，8 周中等强度有氧运动可能直接或间接抑制NLRP3炎性小体激活，减少炎症因子释放，进而发挥肾脏保护作用。