有氧运动对大鼠海马和大脑皮质P2X7受体表达的影响

2021-02-13沈钰琳王雪冰冯连世路瑛丽

中国运动医学杂志 2021年12期

沈钰琳王雪冰，2 冯连世路瑛丽

1 国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

2 广西大学体育学院（南宁530004）

嘌呤能信号传递开始于细胞向胞外分泌以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）为主的核苷酸。嘌呤受体按照作用物不同分为腺苷作用的Pl受体和ATP及其类似物作用的P2受体[1]。核苷酸P2X受体属于配体门控的离子通道，具有传递细胞外ATP 的离子转换作用，在哺乳动物中已发现P2X 受体的7 个亚型（P2X1-7），广泛分布于呼吸系统、消化系统、心血管系统、生殖系统、骨骼肌系统和神经系统[2-3]。其中的一个亚型嘌呤2X7受体（Purinergic 2X7 receptor，P2X7）被高浓度的细胞外ATP激活，使Ca2+和Na+进入，K+通过浆膜向外流动，经过多次刺激后，形成更大的膜孔，影响细胞稳态[4]。有研究发现，P2X7受体在大脑海马、皮质等多个区域以及脊髓等组织都有表达，参与调节中枢神经系统生理功能，与神经病理痛、抑郁症、癫痫、阿尔茨海默症等疾病的发病相关[5-7]。此外，P2X7可导致小胶质细胞激活，促进炎症因子白细胞介素1β（interleu⁃kin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF -α）的产生，加重神经退行性疾病中的细胞损伤[8]。有研究表明P2X7可能激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和丝裂酶原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，并与炎症性疾病密切相关[9]。

研究显示，有氧运动对改善中枢神经系统功能，延缓帕金森、阿尔茨海默症等神经退行性疾病有着积极的作用[10-11]，但目前关于有氧运动对中枢神经系统功能的调控机制尚不十分明确。因此，本研究通过4 周有氧训练，观察大鼠海马和大脑皮质P2X7受体及其相关信号通路表达的变化，为有氧运动保护大鼠中枢神经系统功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

14 周龄雄性SD 大鼠20 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重460～520 g。大鼠在自然光照、环境温度21°C ～23°C、湿度40%～60%的动物房内饲养，自由进水进食。2 周的适应性喂养和训练（速度从16 m/min 逐步递增到30 m/min，运动时间从20 min/d递增到60 min/d）后，随机分为安静组（C组）和训练组（T 组），每组10 只。训练组大鼠于水平跑台进行有氧耐力训练，采用中等强度跑台训练，相当于50%VO2max 运动负荷强度，跑台训练速度为30 m/min，每天运动1小时，每周5天，共4周[12]。

1.2 取材

训练第4周末，各组大鼠禁食禁水12 h，给予10%水合氯醛溶液（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，每组取6只大鼠腹主动脉取血，断头。迅速放在冰袋上取双侧海马和部分大脑皮质，PBS漂洗后置于冻存管，放入液氮罐内冷冻，随后将样品转入－80℃冰箱中保存，用于RT-qPCR、Western Blot 和ELISA 检测。每组剩余4 只大鼠，麻醉后断头，完整取下整个大脑，置于4% PFA中固定，放入4℃冰箱保存，用于免疫荧光检测。

1.3 主要试剂与仪器

兔抗P2X7 多克隆抗体（Alomone Labs），兔抗NFκB p65多克隆抗体（Affinity），山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（Jackson），小鼠抗GFAP 多克隆抗体（Bioleg⁃end），小鼠抗β-actin 单克隆抗体，兔抗P38 多克隆抗体、兔抗p-P38 多克隆抗体、兔抗JNK 多克隆抗体、兔抗p-JNK多克隆抗体（CST），辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥），Trizol 试剂（Invitrogen），逆转录试剂盒、Premix Taq™（Ex Taq™ Version 2.0）试剂盒（TaKaRa），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒（eBioscience），Roche Light⁃Cycler®480II 实时荧光定量PCR 系统（Roche，CH），倒置显微镜（Olympus），成像系统（Q-Imaging）。

1.4 RT-qPCR检测

应用RT-qPCR 检测各组大鼠海马和大脑皮质P2X7 mRNA 表达。将－80℃冰箱中的海马和大脑皮质组织取出，分别置于匀浆器（预先用DEPC 处理）中，放在冰盒内研磨。加入Trizol 混合提取RNA，再加入100 μl无核酶水，溶解RNA。用分光光度计读取OD260/OD280比值及RNA 浓度。根据逆转录试剂盒说明书条件将提取的RNA 取1 μg 逆转录成cDNA。按照Pre⁃mix Taq™（Ex Taq™Version 2.0）说明书要求，配制10 μl 的反应体系。引物序列如下：P2X7 上游引物5’-GATGGATGGACCCACAAAGT-3’，下游引物5’-GCTTCTTTCCCTTCCTCAGC-3’；β-actin 上游引物5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’。使用Roche LightCycler®480II 实时荧光定量PCR 系统进行扩增并对结果进行分析。设置PCR 反应条件：95°C 5 min预变性后，95°C 10 s，60°C 30 s，72°C 30 s，40 个循环。结果使用2－△△CT法表示目的基因相对表达量。

1.5 Western Blot检测

应用Western Blot 检测大鼠海马、大脑皮质P2X7、核转录因子-κB p65（nuclear factor kappa-B p65 p65）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activat⁃ed protein Kinase，p38）、磷酸化p38（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinas，p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）蛋白的表达。取大鼠海马和大脑皮质置于组织匀浆器中，预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，研磨混匀；置于低温离心机（4℃）中12000 rpm 离心15 min，取上清，加入6×loading buffer，放入120°C水浴锅中加热5 min使蛋白变性。SDS-PAGE 电泳，转膜，根据抗体条带位置剪下合适宽度的膜，分别浸在一抗兔抗P2X7 IgG（1 ∶300）、兔抗NF-κB p65 IgG（1:500）、兔抗P38 IgG（1∶1000）、兔抗p-P38 IgG（1∶1000）、兔抗JNK IgG（1∶1000）、兔抗p-JNK IgG（1∶1000），以及小鼠抗β-actin IgG（1∶1000）中，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10 min，将膜转至山羊抗兔IgG-HRP（1 ∶10000）、山羊抗小鼠IgG-HRP（1 ∶10000）二抗中室温震荡孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min。ECL 滴加到膜的蛋白面，反应3～5 min；胶片曝光10 s～5 min（曝光时间随不同光强度调整），显影2 min，定影。通过Image-Pro Plus 图像分析软件读取目的条带的光密度扫描值，以各组条带β-actin 的扫描值标化其相应组待测因子的蛋白表达量。

1.6 免疫荧光染色

应用免疫荧光染色法观察大鼠海马、大脑皮质P2X7阳性细胞的表达。将已在4%PFA中固定48 h后的大鼠大脑组织取出，4 °C脱水（浸入30%的蔗糖24 h进行脱水处理，每8 h更换一次蔗糖水）。用恒冷切片机将组织切成10～12 μm厚的薄片，放入烤箱37°C烤片2 h，－20 °C 保存。取出切片平衡室温30 min，用PBS 缓冲液清洗3 次，每次5 min。滴加10%山羊血清于37°C水浴锅内封闭1 h。用滤纸擦干封闭液，PBS清洗3 次，每次5 min，擦干，按比例配制一抗（P2X7 稀释比例1∶100），混匀，滴加在玻片上覆盖组织，放入4°C冰箱过夜。次日室温放置30 min后，用PBS清洗3次，每次5 min 洗去一抗后加入带有荧光标记的二抗（山羊抗兔TRITC：1∶200），放入37°C 水浴锅中避光孵育1 h。置于PBS缓冲液避光洗涤3次，每次5 min，用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像，分析结果。

1.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）

采用ELISA 实验检测各组大鼠海马和大脑皮质TNF -α、IL-1β和IL-6 的表达水平。取各组大鼠部分海马和大脑皮质加入PBS 于冰上研磨，4℃条件下12000 r/min 离心15 min，取上清。从冰箱内取出试剂盒，置于室温下平衡30 min。标准品、生物素标记抗体、ABC 工作液按试剂盒说明书的要求配置。核算样本所需的已包被抗体的酶标板孔数目，参照试剂盒说明书完成后续各步骤操作。用酶标仪在450 nm 测定吸光值。绘制标准曲线，根据样本吸光值，计算样本中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

1.8 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，所有统计数据结果以均数± 标准差（x±s）表示，显著性检验选择独立样本t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动对大鼠海马和大脑皮质P2X7表达的影响

实验结果显示，经过4 周有氧运动，T 组大鼠海马（0.25 ± 0.05）和大脑皮质（0.42 ± 0.07）P2X7 mRNA的表达水平较C 组（1.00 ± 0.00）显著下降（P＜0.01）（图1A）；在P2X7 蛋白表达水平方面，T 组大鼠海马（0.45 ± 0.09）和大脑皮质（0.38 ± 0.11）较C 组海马（0.98 ± 0.09）和大脑皮质（0.79 ± 0.13）均显著下降（P＜0.01）（图1B、C）。

图1 各组大鼠海马和大脑皮质P2X7 mRNA和蛋白的表达

2.2 各组大鼠海马和大脑皮质P2X7免疫荧光染色结果

图2 结果显示，T 组大鼠海马和大脑皮质P2X7 免疫荧光染色阳性细胞数量显著少于C 组（P＜0.01），其中，T 组大鼠海马P2X7 阳性细胞比例为6.58% ±2.14%，C组25.20% ± 3.82%；大脑皮质中P2X7阳性细胞的表达比例为T 组55.22% ± 4.38%，C 组80.50% ±7.87%。

图2 各组大鼠海马和大脑皮质P2X7免疫荧光染色

2.3 有氧运动对大鼠海马和大脑皮质p65、P38、JNK信号通路表达的影响

结果显示，4 周有氧训练后，各组大鼠海马和大脑皮质中P38、JNK 蛋白的表达无显著差异（P＞0.05），在海马组织中，C 组大鼠P38 和JNK 蛋白表达量分别为0.89 ± 0.10、0.52 ± 0.09，T 组分别为0.95 ± 0.13、0.53 ± 0.10；在大脑皮质中，C 组大鼠P38 和JNK 蛋白表达量分别为0.91 ± 0.19、0.85 ± 0.17，T 组分别为0.94 ± 0.17、0.83 ± 0.14（图3B、C）。

与C 组相比，T 组大鼠海马和大脑皮质p65、p-P38以及p-JNK蛋白表达水平均显著下降（P＜0.01），其中，C 组大鼠海马p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表达量分别为1.05 ± 0.18、0.61 ± 0.14、1.06 ± 0.15，T 组分别为0.53 ± 0.10、0.32 ± 0.09、0.69 ± 0.10；C 组大鼠大脑皮质p65、p-P38 和p-JNK 蛋白表达量分别为0.99 ±0.12、1.01 ± 0.18、1.06 ± 0.17，T 组分别为0.54 ±0.11、0.42 ± 0.10、0.61 ± 0.12（图3D、E、F）。

图3 各组大鼠海马和大脑皮质p65、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白的表达

2.4 有氧运动对大鼠海马和大脑皮质炎症因子表达的影响

图4 结果显示，T 组大鼠海马和大脑皮质TNF-α、IL-1β和IL-6 较C 组均显著下降（P＜0.01）。其中，T 组大鼠海马TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达量分别为10.98± 0.99、4.26 ± 0.14、14.22 ± 2.00，C 组分别为13.49± 0.88、5.27 ± 0.31、22.65 ± 2.74；T 组大鼠大脑皮质TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达量分别为50.00 ± 2.63、3.87 ± 0.37、14.52 ± 3.73，C 组分别为63.20 ± 6.63、5.99 ± 0.94、30.78 ± 2.28。

图4 各组大鼠海马和大脑皮质TNF-α、IL-1β和IL-6的表达

3 讨论

P2X7受体在神经系统的几种细胞类型，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、施万细胞和一些神经元中都有表达[13-14]。其与许多神经系统疾病相关联，如多发性硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿病和癫痫等。在中枢神经系统中，P2X7受体被激活后会导致主要兴奋性神经递质谷氨酸和ATP的释放[15]。在成年人大脑中，P2X7受体参与神经元细胞在发育和死亡过程中向胶质细胞表型的分化[16-17]。有研究发现，脊髓损伤与P2X7受体激活时间延长有关，可导致神经元兴奋性毒性[18]。有氧运动对多种中枢神经系统疾病如阿尔兹海默症、帕金森病的恢复以及延缓大脑衰老都具有积极作用，长期有氧运动能够增强海马神经元活性，减少脊髓前角神经元的丢失，对神经元产生保护作用[19-20]。此外，有氧运动还可通过抑制P2X7 受体改善高脂饮食大鼠心肌炎症、纤维化和细胞凋亡，降低氧化应激反应，延缓大鼠糖尿病肾病的病程进展[21-22]。本研究结果显示，经过4 周跑台训练后，T 组大鼠中枢神经系统海马、大脑皮质组织中的P2X7受体mRNA和蛋白表达水平较C 组大鼠均显著下降，且免疫荧光实验结果显示，P2X7抗体染色后T组海马和大脑皮质P2X7阳性细胞显著少于C 组，说明有氧运动能够降低大鼠海马和大脑皮质中P2X7 受体的表达，提示P2X7 受体可能是有氧运动保护中枢神经系统功能的一个靶点。

P2X7 受体调控非选择性Ca2+通道，从而介导K+、Na+及Ca2+的通透性变化。它可以介导Na+和Ca2+内流以及K+外流，并激活NF-κB和MAPK等多条信号通路，诱导IL-1β、IL-6 和TNF-α的生成[23-24]。NF-κB 在哺乳动物细胞中是一种重要的转录因子，可以绑定各种细胞基因启动子和增强子序列，通过控制许多重要的细胞因子、粘附分子和趋化因子，在免疫反应、炎症反应以及细胞生长调控中起着重要作用，参与细胞增殖和凋亡过程[25-27]。NF-κB p65是NF-κB 通路中一个重要的转录子，可与基因启动子或增强子特异性结合启动转录，NF-κB p65 蛋白由胞浆向核转移是NF-κB 信号通路激活的关键点[28]。NF-κB 的激活需要P2X7 受体介导的信号转导，嘌呤能信号通过P2X7受体选择性靶向激活NF-κB[29]。细胞外ATP 可通过P2X7R-NFκB（p65）途径促进炎性细胞因子释放，已有研究表明，P2X7 激动剂可激活NF-κB p65 信号通路，而使用P2X7抑制剂则会抑制p65的表达，说明P2X7受体参与NF-κB信号通路的调控[30-31]。研究显示，适当强度的有氧耐力训练可以避免中枢神经系统细胞受到各种应激损伤，可通过抑制NF-κB 的活化发挥对阿尔兹海默病大鼠大脑的保护作用[32-33]。MAPK 信号通路调节包括p38、ERK 和JNK 在内的基因的表达，这些基因与免疫和炎症反应相关，p38的激活会导致caspase-3的产生，并最终导致细胞死亡[34]。有研究证实，抑制P2X7 和MAPKs在帕金森和脑出血模型中提供了显著的神经保护作用[35-36]。P2X7可以介导p38MAPK 的磷酸化，激活JNK信号通路，P2X7拮抗剂能够通过阻断p38MAPK的磷酸化抑制细胞凋亡，从而起到神经保护功能[37-38]。本实验结果发现，4周跑台有氧训练后，大鼠海马、大脑皮质组织p65 蛋白表达水平较对照组均显著下降；各组大鼠海马和大脑皮质中P38、JNK 无显著差异，改变体现在其磷酸化水平，T组大鼠p-P38和p-JNK的表达较C组相比显著下降。这表明有氧运动在抑制P2X7受体表达的同时，能够降低大鼠海马、大脑皮质p65 的表达，抑制P38和JNK蛋白的磷酸化，从而抑制NF-κB以及MAPK 信号通路。此外，P2X7 受体参与调节炎性因子的分泌，NF-κB 的激活也常伴有炎症细胞聚集以及未成熟炎症细胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的合成，抑制或敲除P2X7受体可有效阻断IL-1β等炎症因子的产生[4]。本研究也发现，与对照组相比，训练组大鼠海马和大脑皮质中炎症因子TNF-α、IL-1β以及IL-6 的表达水平均显著下降，说明有氧运动可能通过抑制大鼠海马和大脑皮质P2X7受体的产生，减少炎症因子的表达，发挥对中枢神经系统的保护作用。