低氮、磷下不同促生菌组合对黑麦草生产性能的影响

杨彩琼， 李 安， 杨义成， 王小利， 王子苑， 舒健虹

(1.凯里市农业农村局， 贵州 凯里 556000； 2.贵州省农业科学院草业研究所， 贵阳 550006；3.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵阳 550025)

黑麦草(LoliumperenneL.)属于禾本科一年生或多年生优良牧草，在我国长江中下游及其以南各地均有大面积栽培[1-2]，其优势在于充分利用田间水、热、光、气等自然资源实施引草入田。可解决冬春季因青绿饲草不足而家畜生长缓慢、掉膘甚至死亡问题。一年生黑麦草是一种高产耐寒，适口性佳，粗蛋白含量高的优质牧草。利用冬闲田种植一年生黑麦草，既能提供食草家畜冬季所需营养，增强抵抗能力，又提高了土地复种指数，还可以将草收割后残存在田土中的根系翻沤作肥培肥土壤[3-4]。为了其产量能够持续供应，需要满足农作物生产所需的氮、磷等营养元素，工业化肥一直被认为是实现这一目的主要途径。然而随着集约化的农业生产加剧了温室效应，并造成了严重的环境问题，如大气污染、地表水和地下水富营养化以及土地酸化和降解[5]，微生物和植物都共生于土壤中，近年来已将微生物群落解释为植物抗逆性的关键因素，可通过微生物的活动增加植物养分的供应，促进植物生长，提高作物产量，改善作物品质。植物根际促生菌通过机制包括增加营养物质的供应，产生植物激素，增强其他有益细菌对植物病害的控制[6-11]等一系列生防机制，促进植物对营养的吸收，有利于植物生长提高产量。禾本科牧草和禾谷类作物根际及叶际具有与豆类作物类似的生物固氮、溶磷及分泌植物激素的菌株[12]。虽然从实验室所获得的菌株在理论上有一定的促生效果，但关于多种菌混合接种植物体的盆栽试验及其促生效应至今研究不多[13]。因此，为了探索固氮菌和溶磷菌组合菌剂对黑麦草生产性能的影响，本研究以禾本科和豆科植株根际分离筛选的固氮菌、溶磷菌种为材料进行组合实验，探讨不同菌种组合对黑麦草生长性能的影响，以及菌株间分泌激素和有机酸的变化，以期为黑麦草等禾本科牧草与禾谷类作物微生物菌肥的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

黑麦草品种为邦德(Abundant)黑麦草，种子购于贵阳霖卉园林绿化有限公司。

供试菌株为本试验前期从当地豆科和禾本科牧草根际分离的固氮菌和溶磷菌株，并利用黑麦草进行回接筛选实验，将黑麦草产量较高的供试固氮菌株和溶磷菌株，分别进行两两交叉划线拮抗试验，选择不发生拮抗反应的3株固氮菌株(CS 34-3、CS 6-3-2、CS 1-5)和3株溶磷菌株(PD 4-5、P 35-2、P 33-3)，将菌株制备成菌悬液进行复合菌种试验，见表1。

表1 供试菌种来源及编号

1.2 复合菌的培养

将供试促生菌接种在固体LB斜面上活化，然后转接在LB液体培养基中，28 ℃，150 r·min-1，摇床培养，菌株培养2 d，用液体LB培养基调OD值(λ=600 nm)，使菌体浓度达109个·mL-1，按1∶1的比例[15]分别吸取固氮菌和溶磷菌进行混合培养，其总量为150 mL，ck(LB培养液)，菌株培养2～3 d后进行灌根处理，复合菌剂处理组合见表2。

1.3 Hoagland全营养液

配方如下：1.25 mM KNO3，1.25 mM Ca(NO3)2·4 H2O，0.5 mM MgSO4·7 H2O， 0.25 mM KH2(PO4)， 11.6 μM H3BO3，4.6 μM MnCl2·4 H2O，0.19 μM ZnSO4·7 H2O，0.12 μM Na2MoO4·2 H2O，0.08 μM CuSO4·5 H2O和10 μM Fe(III)-EDTA[17]。

注：缺乏氮素的系统中，NO3-为被Cl-取代，在缺磷的系统中(PO4)3-被(SO4)2-取代。

1.4 蛭石盆栽试验

选择无虫害的黑麦草种子，在75%的酒精中浸泡2 min，用3%次氯酸钠灭菌10 min，然后用无菌水清洗5～6次，播种在盛有灭菌并混有磷矿粉120 g的蛭石塑料盆(8.2 cm×11 cm)中，每盆20颗种子，将植株置于白天25 ℃、夜间25 ℃、每天光照16 h的人工气候室中培养。出苗后每盆留生长一致的幼苗12株，每个花盆用针打入40 mL的复合菌液(20 mL菌液+20mL无菌水)，不接种用相同处理量的LB培养液为全空白对照，每个处理设5次重复，随机区组排列。幼苗喷施不同的Hoagland营养液(上海国药、表2) 保持基质湿润，处理培养30 d，植株生长共43 d后收获。

表2 试验设计

1.5 促生菌株分泌激素和有机酸种类及含量分析

参考王召娜等[18]的方法，取第9天的培养液采用高效液相色谱法测定其有关激素和有机酸成分。

1.5.1发酵液成分测定

取一定量的发酵液，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取1 mL上清液，用针头式过滤器滤膜(0.45 um)过滤于带有内衬管的样品瓶内待测。

1.5.2标准品混合液制备

分别准确称量激素(GA3、IAA、ZT)和有机酸(苹果酸、草酸、柠檬酸、甲酸、乳酸、丁酸)标准品，将其溶解后定容即标准品混合液。

1.5.3含量测定

激素和有机酸含量使用HPLC(Aglient 1260)分析。

1.6 促生菌对黑麦草地上部分的影响

每一处理的每个重复中随机选取5株(共25株)测量株高，植株高度为地面到旗叶的高度。刈割后每盆选取10株为一个整体测定，每组测5个重复(以第一片叶叶痕处为划分标准)，称地上部分的鲜重；在105 ℃下杀青15 min，65 ℃烘干至恒重，称重。

1.7 植株全磷、全氮含量的测定

全氮含量采用全自动凯氏定氮法测定，全磷含量采用紫外可见分光光度法[16]。

1.8 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 18.0软件进行统计分析，采用Tukey多重比较检验不同处理间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同复合促生菌对黑麦草单株干物质产量的影响

不同复合促生菌剂对黑麦草单株干物质产量都有促进作用(图1)，处理组黑麦草单株干物质产量在1.25～1.78 g之间，对照组为0.72～1.36 g。促生效果最显著的是复合菌剂B 3，其单株干物质产量为1.78 g，较ck1、ck2和ck3分别增加30.88%、81.63%、147.22%，差异极显著(p<0.01)；其次是处理组B 1、B 2、C 2和C 1与ck1(全营养液)相比分别增加22.79%、16.91%、11.69%、8.82%，差异极显著；A 1和A 2的单株干物质产量明显低于ck1，与相同营养液培养的ck2相比增加27.55%、30.61%，差异极显著；单株干物质产量顺序为：B 3>B 1>B 2>C 2>C 1>B 4>ck1>A 2>A 1>ck2>ck3。表明所施加复合促生菌剂的黑麦草植株对其地上生物量都有促生作用，其中B 3、B 1、B 2、C 2这4个组合最有利于增加黑麦草植株产量。

图1 不同复合促生菌剂对黑麦草植株地上生物量的影响

2.2 不同复合促生菌剂对黑麦草株高的影响

不同复合促生菌对黑麦草生长都有促进作用(除A 2外)，处理组B 4、B 3和B 2与ck1相比植株增高25.99%、24.63%、13.33%，差异极显著(表3)；其次为B 1、C 2和C 1组合菌剂，较ck1分别增高10.61%、9.64%、5.62%，差异不显著(p>0.05)，与ck2相比分别增高31.80%、30.64%、25.84%，差异极显著；处理组A 1、A 2的株高均比ck1显著降低，A 1与ck2相比增加9.91%，但差异不显著；对黑麦草株高的促进效果依次为：B 4>B 3>B 2>B 1>C 2>C 1>ck1>A 1>ck2>A 2>ck3。所进行的不同复合菌剂处理试验中A 2对黑麦草株高生长的促进效果最差，B 4、B 3、B 2和B 1这4个组合菌剂最有利于促进黑麦草株高的生长。

表3 不同促生菌对黑麦草株高的影响

2.3 不同复合促生菌对黑麦草植株N、P含量的影响

如图2所示，不同复合促生菌剂对黑麦草植株吸收氮量的影响不同，处理组A 1、A 2与ck1相比黑麦草植株全氮含量分别增加12.07%、10.53%，差异极显著；处理组B 1、B 4、C 1、C 2与ck1和ck2相比植株全氮量极显著降低，与ck3相比增加1.17%～2.33%，但差异不显著；处理组B 2和B 3与ck3相比植株的氮含量降低2.33%、2.72%，但差异不显著，不同处理黑麦草植株氮含量顺序为：A 1>A 2>ck1>ck2>C 1>B 1>B 4>C 2>ck3>B 2>B 3，在所进行的试验组合中，A 1和A 2对黑麦草植株吸收氮元素的促进作用最佳。

图2 A、B不同组合促生菌剂处理对黑麦草植株吸收氮、磷量的影响

不同复合促生菌剂对黑麦草植株全磷量的影响不同(图3)，处理组A 2与ck1相比增加9.54%，差异极显著，A 1与ck1相比增加5.59%，差异不显著；C 1与ck2相比降低2.03%，差异不显著；B 2、C 2、B 1、B 3和B 4较ck1和ck2处理的植株磷含量显著降低，但与ck3相比增加27.42%～42.47%，差异极显著。不同处理黑麦草植株磷含量顺序为：A 2>A 1>ck1>ck2>C 1>B 4>B 3>B 1>C 2>B 2>ck3， 在所进行的试验组合中A 1和A 2对黑麦草植株吸收磷元素的促进作用最佳。

2.4 不同复合促生菌分泌激素的含量

为了进一步了解不同复合促生菌剂分泌激素、有机酸的种类及含量，选择了关联性高的6个组合菌株液体培养生长进行测定。由表4所示，施入组合菌液A 2的黑麦草ZT含量最高，B 1和C 1与A 1相比增加20.41%、22.30%，差异极显著，B 4和C 2与A 2相比下降6.47%、17.41%，差异极显著；GA3含量最高的组合菌剂是C 2，B 1与A 1相比增加33.68%，差异极显著，C 1与A 1相比有所增加，差异不显著，B 4和C 2与A 2相比增加40.13%、160.19%，差异极显著；IAA含量最高的组合菌剂是C 2，B 1与A 1相比增加35.94%，差异极显著，C 1与A 1相比降低28.13%，差异极显著，B 4和C 2与A 2相比增加39.39%、15 033.33%，差异极显著。在试验中C 2组合所分泌的IAA和GA3含量最高，分泌激素总含量依次为C 2>B 4>A 2，B 1>C 1>A 1。

表4 不同复合促生菌剂分泌激素的含量 单位：μg·mL-1

2.5 不同复合促生菌分泌有机酸的含量

从表5看出，在液体培养中复合促生菌剂分泌有机酸的种类和含量差异很大，分泌草酸最高的是C 1，为297.41 μg·mL-1，组合菌株中B 1和C 1与A 1相比增加44.32%、48.80%，差异极显著，B 4和C 2与A 2相比降低29.15%、93.51%，差异极显著；甲酸含量最高的是C 2，为407.11 μg·mL-1，B 1与A 1相比增加37.54%，差异极显著，C 1与A 1相比降低39.59%，差异极显著，B 4和C 2与A 2相比增加174.24%、432.38%，差异极显著；苹果酸含量最高的是C 2，为454.23 μg·mL-1，B 1与A 1相比增加43.94%，差异极显著，C 1与A 1相比有所增加，但差异不显著，B 4与A 2相比降低54.45%，差异极显著，C 2与A 2相比增加519.43%，差异极显著；乳酸含量最高的是B 4，为209.95 μg·mL-1，其他组合菌剂分泌量为20.65～119.33 μg·mL-1，含量高低为B 4>A 2>C 2，B 1>C 1>A 1，组合间差异极显著；柠檬酸含量最高的是A 2，为65.86 μg·mL-1，其他组合菌剂分泌量为11.18～26.45 μg·mL-1，含量高低为A 2>C 2>B 4，组合间差异极显著，B 1=C 1=A 1；丁酸含量最高的是B 4为542.80 μg·mL-1，其他组合菌剂分泌量为30.56～80.70 μg·mL-1，含量高低为B 4>A 2>C 2，A 1>B 1=C 1，组合间差异极显著。总有机酸含量排序为B 4>C 2>A 2，B 1>A 1>C 1。

表5 不同复合促生菌剂培养分泌有机酸的含量 单位：μg·mL-1

3 讨 论

3.1 复合促生菌对黑麦草地上部分的影响

固氮菌可通过固定空气中的氮元素为作物提供氮肥，溶磷菌能将土壤中难溶性磷转化成可溶性磷被植物吸收利用，这将逐渐成为代表未来绿色农业发展的方向之一[19]。然而固氮菌与溶磷菌，以及同一类菌的不同菌株之间，存在着互作与拮抗等关系，促生菌株的实际应用效果非常重要，已有文献对这方面进行报道，如溶磷菌在玉米株高和干重方面分别增加了35.5%和28.9%[20]，PGPR替代 20%化肥可使豌豆经济产量增加 3.2%[21]，促生菌能促进大豆和百脉根作物增产和品质提高[20]。本实验通过不同促生菌组合对黑麦草地上生物量和株高的影响得知，施入B 3、B 1、B 2、C 2和C 1复合菌剂的黑麦草干物质产量极显著高于ck1；A 1和A 2极显著高于ck2；干物质产量依次为：B 3>B 1>B 2>C 2>C 1>B 4>ck1>A 2>A 1>ck2。对黑麦草株高影响，B 4、B 3和B 2极显著高于ck1，B 1、C 2和C 1极显著高于ck2；促生效果依次为：B 4>B 3>B 2>B 1>C 2>C 1>ck1>A 1>ck2>A 2；综合单株干物质产量和株高来看，B 3、B 1、B 2组合最好。说明只有筛选出较佳的溶磷菌与固氮菌组合才具有“1+1>2”的良好互作效应，不同菌株组合的加成效应与韩华雯等[24]和舒健虹等[18]的研究结果相同。可见多固氮菌剂组合比单一固氮菌剂组合的促生效果显著，但并不是简单的叠加组合，只有深入研究PGPR的作用机理，筛选具有叠加促进效应的菌株组合，才能充分发挥复合菌剂的促生增质效果[23]。

3.2 复合促生菌对黑麦草氮、磷含量的影响

有研究表明，土壤中磷细菌的生命活动可增加土壤水溶性磷含量，为固氮菌提供磷素营养，而固氮菌的存在不但增加了土壤的氮素含量并且在其生命活动中合成和分泌的生理活性物质，加速了磷细菌芽孢的萌发，从而增加了水溶性磷形成过程[24]，而植株氮元素含量增加能够促进磷元素的吸收[25]。在对黑麦草植株氮、磷含量的分析中可知，施加单一固氮菌加溶磷菌组合菌剂(A 1、A 2)的黑麦草植株氮含量极显著大于ck1，磷含量A 2极显著大于ck1，A 1比ck1有所增加，差异不显著。施加B和C组合剂的黑麦草植株氮、磷含量极显著低于A组合和ck2处理的植株，但其氮、磷含量极显著优于ck3处理的植株。此结果与吴统贵等[27]和李小冬等[28]的研究结果一致。这可能是因为植物在持续生长和生物量不断增加的同时，氮、磷含量逐渐稀释降低，植株产量增加与氮、磷含量不成正比。

3.3 复合促生菌分泌激素的差异

激素能够调控植株的生长发育，IAA与GA3作为植物的重要内源激素之一，具有促进植株生长和延缓衰老的功效[28]，当IAA含量降低时植株生长会受到一定的抑制[29]，Law证实，GA3可以促进L-色氨酸转化为D-色氨酸，进而被合成IAA[30]，ZT能提高小麦、高羊茅、多年生黑麦草等植物的抗旱性[31-32]。在对不同复合促生菌株激素含量的分析中可知，黑麦草ZT含量B 1和C 1极显著高于A 1，B 4和C 2极显著低于A 2；黑麦草GA3和IAA总含量B 1>A 1=C 1，C 2>B 4>A 2；IAA含量B 1>A 1>C 1，C 2>A 2>B 4，差异极显著。在进行试验中C 2组合所分泌的IAA和GA3含量最高，但黑麦草株高B 4>B 1>C 2>C 1>A 1>A 2；干物质产量B 1>C 2>C 1>B 4>A 2>A 1，可能根系分泌物与菌株的互作还存在其他激素促进黑麦草生长，还需下一步深入研究。

3.4 复合促生菌分泌有机酸的差异

有机酸可以不同程度地增加Ca 2-P、Ca 8-P的含量，促进难溶性磷向可溶性磷转化，其中草酸>柠檬酸>酒石酸[33]，在低磷条件下，柠檬酸、草酸、酒石酸能够抵制土壤对磷的吸附，达到解磷效果[34]。试验中复合菌剂分泌的草酸C 1>B 1>A 1，A 2>B 4>C 2，组间差异极显著；柠檬酸A 2>C 2>B 4，组间差异极显著，A 1=B 1=C 1；苹果酸含量B 1>C 1=A 1，C 2>A 2>B 4；总有机酸B 1>A 1=C 1，B 4>C 2>A 2，组间差异极显著，但黑麦草植株磷含量为A 2>B 4>C 2，A 1>C 1>B 1，可见细菌的溶磷过程非常复杂，不能仅仅靠分泌有机酸含量来作为判断指标，必须考虑复合菌种的互作及在宿主根系分泌物的影响下对微生物生长环境的改变，从而影响宿主的产量、品质和抗性，在综合环境中寻找具有最佳效应的复合促生菌剂，才能充分发挥PGPR的促生增质效果[35]。

4 结 论

不同促生菌组合对黑麦草单株干物质产量、株高、及N、P含量都具有一定促生作用，B组合对黑麦草促生效果较佳，A组合提高黑麦草氮、磷含量最高。组合菌株C 2和B 4分泌的GA3、IAA和ZT激素含量最高，B 4和C 2分泌的总有机酸含量最高。综合分析B 1为最佳复合菌剂，可作为黑麦草专用生物菌肥推广，优质促生菌的筛选必须考虑复合菌种的互作及在宿主根系分泌物的影响下对微生物生长环境的改变，进而影响宿主的产量、品质和抗性，所以在开展推广应用前还需进行与寄主植株的筛选试验。