补肾中药在细胞分子水平调控骨重建的研究❋

姜朝阳， 谢兴文， 徐世红， 李鼎鹏， 柳 博， 钟建春， 林德民， 罗鹏飞

(1.甘肃中医药大学， 兰州 730000；2.西北民族大学附属医院， 兰州 730000；3.甘肃省第二人民医院， 兰州 730000；4.甘肃省中医院， 兰州 730000)

骨重建(Bone Remodeling)是骨重建单元进行的一种细胞活动，成骨细胞(osteoblast,OB)和破骨细胞(osteoclast, OC)是骨重建单元最基本的构成元素，生理性骨重建是在OC去除矿化骨、OB形成骨基质，二者协调统一下完成的[1，2]，它贯穿于生命的全过程。当机体内环境稳态失衡时，成骨活动与破骨活动的偶联平衡被打破，进而引发一系列代谢性骨病。如机体雌激素水平下降所引起的内环境紊乱，致使OC过度分化并由骨髓向矿化骨表面移行、黏附，从而导致骨吸收增加、OB活性降低引起骨形成减少，骨微观结构发生改变，最终导致骨骼脆弱，增加了骨折风险[3]。然而有研究表明[4]，部分补肾中药的效应物质通过作用于相关靶蛋白，调控成骨与破骨细胞活性，在改善骨代谢方面效果显著，具有一定的临床应用价值。因此，本文就补肾中药在细胞分子水平调控骨重建的相关研究做一述评，旨在为代谢性骨病的防治提供新策略。

1 骨重建

生理性骨重建的完成需要不同骨细胞之间的直接通讯，包括OB(成骨细胞、骨细胞、骨衬细胞)和OC及其前体细胞所组成的骨多细胞单位(bone multicellular units,BMU)[5]。OB主要来源于骨髓基质中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemocells, BMSCs)，BMSCs在Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)等因子诱导下向OB分化，OB不断增殖、矿化重建骨形态。这一阶段的完成需要磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinosito 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、Wnt蛋白/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)等众多信号通路共同完成[6]。而OC是骨髓造血干细胞来源的大型多核巨细胞(含有3-100个细胞核)[7]，主要分布于骨皮质及骨内血管周围，当破骨前体细胞受到巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)激动后，会定向分化为成熟的OC。在此过程中，OC从骨髓向矿化骨表面移行并黏附，发挥生理性骨吸收作用。

生理性骨重建对维持骨代谢平衡有着至关重要的作用，骨重建周期也是一个高度协调、持续终生的过程，由5个紧密衔接的阶段构成，即活化、再吸收、逆转、形成和终止[8]。同时在该过程中，不同的调节因子参与到骨重建周期的每一个阶段(见表1)。首先在骨重建活化阶段，破骨单核细胞密切监测捕捉任何重建信号，并在M-CSF、RANKL等启动因子的介导下，彼此识别融合，形成多核巨细胞并迅速移行至矿化部位，启动第二阶段如再吸收。再吸收阶段是维持骨量稳定的关键，这一过程的进行程度及时间取决于雌激素(estrogen,ER)、降钙素(calcitonin,CT)等多种激素负反馈调节，一旦内分泌失调，ER、CT等激素分泌不足，不能充分反馈抑制信号则会导致骨的溶解过度。而再吸收过程主要由两部分构成，一方面OC将碳酸酐酶II产生的质子泵入吸收间室，以溶解矿物质；另一方面当骨表面出现OC时，一些内分泌调节因子如1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2VitD3)、甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)、 胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)等通过诱导成骨前体细胞分化、成熟，并促使OB表达RUNX2细胞信号，进而使得OB数目增加并延长细胞寿命[9]。溶骨与成骨前活动同时进行，以达到逆转前的动态增长平衡，骨重建也由此进入逆转阶段，OC完全消失，成骨细胞发挥骨形成作用。当矿化骨量达到吸收量时，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、糖皮质激素、瘦蛋白、焦磷酸盐、轴突导向蛋白4 D(semaphorin4D,Sma4D)等信号因子负反馈抑制并促进OB凋亡，终止骨重建。此时，一个完整的骨重建过程结束，而在这个过程中任何一个阶段中断或沉默都会造成骨吸收和骨形成之间的不平衡，导致代谢性骨病的发生。

表1 骨重建周期及其调节因子[5]比较

2 补肾中药单体及其有效成分调控骨重建

中医基础理论认为，肾为先天之本，主骨生髓，调控机体生长发育及一切生命活动。现代医学研究发现，补肾中药单体及其有效成分在靶向调控BMSCs向骨细胞分化有显著作用。而中医学依据药物的性味归经将补肾中药分为补肾阳和补肾阴两大类，补肾阳药有淫羊藿、杜仲、骨碎补、仙茅、续断等，补肾阴药有枸杞子、女贞子、黄精、鳖甲等。这些中药单体有效成分基本明确，其对应的化学结构也较为清楚，作用靶点更容易探讨，因此笔者依据相关文献将部分药物单体及有效成分做整理分析(见表2)。

表2 补肾中药单体及有效成分对骨重建药理作用情况

3 补肾中药复方调控骨重建

补肾中药复方在临床中已被广泛应用，尤其在防治OP方面已取得显著的临床疗效。同时，补肾中药复方调控骨重建的机制研究也从动物实验和细胞实验展开，现从骨形成与骨吸收两方面探讨补肾中药复方调控骨重建的作用机制。

3.1 补肾中药复方对骨形成的机制研究

补肾中药复方是基于中医肾主骨生髓思想而创立的古今验方。现代研究发现，这类方剂可通过调控相关基因表达，从而促进BMSCs成骨分化。有研究采用补肾益气活血方(地黄、淫羊藿、鹿茸、牡蛎、黄芪、红花)干预雌性去势OP大鼠，通过检测治疗后骨密度(bone mineral density,BMD)、ALP、Wnt7b、Axin2、RUNX2蛋白及其mRNA表达水平，发现补肾益气活血方可显著增加大鼠股骨BMD，下调血清ALP水平，对雌激素水平下降引起的OP有应用价值，推测其过程可能是通过上调Wnt7b/β-catenin信号通路来促进成骨分化[29]。同时学者通过体外细胞实验发现[30]，补肾活血方组Axin2、RUNX2 mRNA及蛋白表达均上调，证实补肾益气活血方通过Wnt7b/β-catenin信号通路，促进成骨分化机制。此外，补肾健脾活血方也可以通过上调RUNX2 mRNA基因及蛋白表达促进骨形成。柴爽等[31]建立OP大鼠模型，以补肾健脾活血方(补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣)作为观察组，给药3个月后发现，BMP-2、Smad-1、RUNX2、OPG基因和蛋白表达水平均上调，推测补肾健脾活血方可能是通过BMP-2/Smad信号通路，上调RUNX2基因表达，进一步促进OB分化。文献报道，续骨补肾方(三七、红花、当归、血竭、续断、骨碎补、龙骨、狗脊、淫羊藿、鳖甲、鹿角胶)也可促进OB增殖，并通过细胞分子实验证实，其作用机制是通过促进BMP-2以及Ⅰ型胶原mRNA的表达促进OB增殖[32]。此外，右归丸作为补肾阳的常用方剂，在促进骨生长修复骨重建中疗效显著。章建华等[33]通过细胞实验阐述了其作用机制。研究采用右归丸含药血清干预OB，在培养72 h后分别检测ALP含量，β-catenin、细胞外调节激酶1(extracellular signal-regulated kinase1,ERK1)、细胞外调节激酶2(extracellular signal-regulated kinase2,ERK2)mRNA及其蛋白表达情况，结果显示肾阳虚组以上指标含量及表达均上调，认为右归丸作用机制可能是通过Wnt/β-catenin、ERK1/2信号通路，促进OB增殖进而促进骨形成。

3.2 补肾中药复方对骨吸收的机制研究

左归丸(熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、龟板胶、鹿角胶、菟丝子、牛膝)具有补肾滋阴、益精填髓之功效，可显著提高BMD水平，改善骨微观结构，是防治绝经后OP的经典方剂。张澜川[34]采用RANKL诱导小鼠RAW264.7细胞分化为OC，加入ER抑制剂与左归丸含药血清共同干预，发现左归丸含药血清通过ER途径下调促炎因子IL-6，上调抑炎因子IL-10，从而发挥对OC分化的抑制作用。此外，有学者通过动物实验再次验证了左归丸通过调节ER水平影响OC活性这一机制。刘立萍等[35]摘除SD雌性大鼠双侧卵巢造OP模型，给药90 d后取大鼠血清及股骨分析发现，左归丸治疗组OC数量显著减少，TNF-α、IL-17、RANKL水平明显下调，推测左归丸抗去卵巢模型大鼠骨丢失可能是通过减少血清促炎因子，下调RANKL表达，进而抑制破骨细胞活性。同时研究者发现，通过影响自噬相关基因表达水平也可调控OC分化，进一步影响骨吸收。谭登等[36]培养RAW264.7细胞，并诱导细胞破骨分化，采用补肾通络方(骨碎补、淫羊藿、续断、全蝎、蜈蚣、白芍、茯苓、甘草)干预4 d后检测自噬相关因子表达水平，发现补肾通络组肌动蛋白环数目及组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)表达均减少，同时自噬相关基因5(ATG5)、自噬相关基因7(ATG7)、泛素结合蛋白p62(p62)mRNA表达均下调，推测补肾通络方可能通过下调自噬相关基因表达，间接抑制OC分化成熟。

4 结语与展望

骨重建是一个多细胞、多因子、多通路共同调控、持续终生的过程，对于保持骨骼完整性和维持矿物质稳态至关重要。中医学认为，肾为先天之本，藏精主骨生髓。《素问·六节藏象论篇》曰：肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨，强调“肾”“精”“髓”“骨”之间互生互化的密切关系。即肾精充足，则骨髓化生有源，骨得髓养则强壮。若肾精不足，骨髓化生乏源，不能濡养骨骼，则会引起骨骼脆弱、骨质疏松[37，38]。同时，随着高通量技术在医学领域的应用，逐渐阐明了骨髓干细胞与中医学“精”的关系，并发现骨髓干细胞的增殖分化过程与先天之精的转归高度吻合[39]。研究发现，补肾中药单体、有效成分、复方均可调控相关基因、细胞因子的表达，进而影响BMSCs成骨分化，促进生理性骨重建。其中淫羊藿苷、山奈酚等有效成分均可通过提高ALP活性，促进OB分化；淫羊藿、杜仲、骨碎补通过Wnt/β-catenin信号通路，调控下游基因的转录与翻译，进一步促进BMSCs成骨分化，重塑骨结构。此外，部分补肾中药单体及有效成分还可以通过炎症信号通路实现对OC的调控，减少骨丢失。而补肾中药复方则主要通过Wnt、BMPs等分子介导的信号通路发挥作用。不难发现，无论补肾中药单体或复方调控骨重建均与Wnt介导的信号通路具有不可分割的联系[40]。利用补肾中药有效成分通过Wnt信号通路靶向改善骨微环境，将为代谢性骨病的防治研究提供新策略。

虽然相关研究已从临床、动物和细胞多层次展开，但由于中药有效成分较多，各个有效成分之间、药物与药物之间都存在着相互作用关系，导致其调控骨重建的作用机制尚未完全阐明；加之中药复方成分更为复杂，其调控骨重建过程涉及多种细胞因子、信号通路，而各个信号通路之间又存在协同或抑制关系，为明确分子机制增加了难度。因此，利用生物信息学、网络药理学知识，结合细胞、动物实验进一步分析，从而揭示补肾中药调控骨重建的细胞分子机制，仍然是值得研究的方向。