网络药理学预测虎杖-吴茱萸抗痛风作用及验证研究❋

欧水平， 王 森， 杨建文， 王玉和△， 赵创荣

(1.遵义医科大学附属医院， 贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学， 贵州 遵义 563003；3.毕节市第一人民医院， 贵州 毕节 551700)

痛风(gouty arthritis，GA)属于中医学“痹证”范畴，其病因包括内因与外因，内因主要指脾肾不足或肝肾阴虚，外因主要指外感邪气及饮食失调，内外因相结合导致湿、热、 痰、瘀、毒等病邪痹阻经络、沉积于体内。对于其治疗，一般从清热、化湿、祛痰、化瘀及补虚等治法入手[1]。目前治疗痛风的药物主要有秋水仙碱、丙磺舒、别嘌醇等，其副作用比较大，不宜久服[2]，故积极寻找高效低毒的抗痛风药物具有重要的意义。虎杖为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根，具有利湿退黄、散瘀止痛等功效，可用于治疗风湿痹痛、湿热黄疸等。吴茱萸具有散寒止痛、降逆止呕等功效，可用于治疗寒疝腹痛、寒湿脚气等。文献报道[3-5]以及本课题组前期研究[6，7]表明，虎杖和吴茱萸均具有较好的抗GA作用。

中医药治疗疾病以“整体观念”和“辨证论治”为理论指导，以“同病异治”和“异病同治”为治疗原则。网络药理学是基于系统生物学的理论，融合多向药理学、生物信息学及计算机科学等多个学科的技术和内容，对中药的多成分、多靶点以及多通路的特点分析，从多个角度将药物成分靶点网络与疾病靶点网络相结合，系统全面地分析药物的作用机制[8-11]。其在方法学上具有整体性、系统性的特点，与中医药的特点不谋而合。因此，本研究采用网络药理学方法，对虎杖-吴茱萸配伍治疗痛风的主要活性成分、作用靶点及信号通路进行探索，分析其作用机制，并进行初步的药理学实验验证，为低毒、高效抗痛风药物的研制提供科学依据。本研究已通过遵义医科大学实验动物伦理委员会审查，批准号伦审[2020]2-079号。

1 材料

1.1 动物

雄性清洁级SD大鼠60只，体质量(200 ±20)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(湘)2014-0011。饲养于SPF级实验动物房，饲养温度20～24 ℃，湿度40%～60%，12/12 h光照黑暗循环，自由摄食饮水。

1.2 试剂及仪器

尿酸(uric acid，UA)与黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20181015、20181025)，白介素-6(interleukin 6, IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素-10(interleukin 10, IL-10)及白介素-17β(interleukin 17β, IL-17β)试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，批号201810)；虎杖-吴茱萸提取物(自制)。

1510全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)；BCD-579WE冰箱(青岛海尔股份有限公司)；KDC-2044低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；HH-S6水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。

1.3 药品

尿酸钠(Sigma公司，批号SU287501)；秋水仙碱片(广东彼迪药业有限公司，批号20190201)。

2 方法

2.1 活性成分收集与筛选

分别以“虎杖、吴茱萸”为检索词在传统中药系统药理学数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http：//sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php/)中查找虎杖和吴茱萸所含成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-like，DL)≥0.18和半衰期(half life，HL)≥4为筛选指标，筛选虎杖、吴茱萸中的主要活性成分。其中OB值是评价药物发挥药效的重要指标，DL值代表成分与已知化学药物的相似性，对确定中药成分对机体产生活性具有重要参考价值[12]。

2.2 活性成分潜在靶点预测

采用TCMSP平台获得虎杖、吴茱萸活性成分的作用靶点，并通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库将所获得的靶点蛋白名转换成对应的基因名。

2.3 GA相关靶点搜集

以“Gouty arthritis”为关键词，通过检索人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)数据库，获取GA相关的靶点信息。

2.4 活性成分-GA潜在靶点可视化网络构建

通过Cytoscape 3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)，构建虎杖-吴茱萸活性成分-作用靶点相互作用关系网络。

2.5 构建蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI)

采用STRING(https://string-db.org/)在线数据库对靶点蛋白间相互作用进行分析，将交集靶点信息导入STRING数据库，物种选择“Homo sapiens”，得到PPI网络图可视化。

2.6 基因本体(gene ontology，GO) 功能富集分析与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

为进一步探索虎杖-吴茱萸治疗GA靶点在基因功能和信号通路中的作用，本研究进而利用 DAVID 数据库(https://david.Ncifcrf.gov/) 对筛选得到的靶点进行 GO 功能与KEGG 通路富集分析。

2.7 动物实验验证

2.7.1 分组、给药及造模 雄性SD大鼠60只，按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组0.28(mg/kg)、虎杖-吴茱萸提取物剂量组(65、130、260 mg/kg)6组，给药剂量按等效剂量系数折算法计算，按10 mL/kg及每次给药前的大鼠体质量计算给药容积。每天10∶00灌胃给药，连续给药14 d，空白组、模型组每天给予等体积生理盐水，给药12 d后造模，期间继续给药。造模方法参考本项目组前期研究成果[3]。

2.7.2 血清中UA、XOD及炎症因子IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17β含量测定 造模48 h后取材，将大鼠用7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射，麻醉后腹主动脉取血，3500 r/min离心10 min取上清液，按相应的试剂盒说明书进行操作测定。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 活性成分搜集与筛选

表1示，在 TCMSP数据库中筛选得到虎杖活性成分有7个，吴茱萸活性成分有23个，虎杖和吴茱萸均含有2个。

表1 TCMSP数据库筛选得到的虎杖-吴茱萸潜在活性成分比较

3.2 活性成分作用靶点预测与筛选

将搜集得到的32个虎杖-吴茱萸活性成分，在TCMSP数据库筛选去除无对应靶点蛋白的潜在活性成分，合并后最终得到虎杖-吴茱萸26个活性成分，靶点蛋白1057个。将活性成分对应的靶点蛋白通过Uniprot数据库查询其对应的基因，以对获得药物靶点蛋白的来源和基因信息进行校正，并获得正确的编码。

3.3 GA相关靶点搜集与活性成分靶点交集

表2示，在OMIM数据库检索到与GA相关的靶点有283个。将3.2获得的虎杖-吴茱萸活性成分作用靶点与获得的GA相关靶点-取两者的交集，共获得21个虎杖-吴茱萸潜在GA的作用靶点。

表2 疾病靶点和药物活性成分靶点交集比较

3.4 活性成分-GA潜在靶点可视化网络

图1示，活性成分-GA潜在靶点可视化网络图的节点分别代表活性成分和疾病靶点，包括47个节点(26个活性成分和21个靶点)，有着112条相互作用关系。其中黄色三角形是共同作用靶点，绿色椭圆形是药物活性成分。网路图中化合物的平均度值为4.64，度值靠前的靶点有PTGS2、F7、MMP9、TP53、CDKN1A，其度值分别为19、13、9、8、7。度值靠前的化合物有白藜芦醇(resveratrol)、槲皮素(quercetin)、吴茱萸次碱(Evodiamine)、大黄素(emodin)、芹菜素(apigenin)，其度值分别为17、13、10、9、8。活性成分和疾病靶点相互作用时以边来连接，每个活性成分很多个靶点与其作用，每个靶点上也作用着很多种活性成分，体现了虎杖-吴茱萸多成分、多靶点的抗GA作用机制。

图1 活性成分-疾病靶点可视化网络图

3.5 PPI 网络的构建与分析

图2示，采用STRING数据库对21个虎杖-吴茱萸潜在抗GA作用靶点进行PPI蛋白相互作网络分析，获得PPI网络图。PPI网络图的关键节点包括白介素β-1(IL1B)、白介素10(IL10)、白介素6(IL6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、C-C型趋化因子受体2(CCR2)。

图2 PPI网络图

3.6 抗GA潜在靶点GO生物功能富集分析

表3示，对21个虎杖-吴茱萸潜在靶点抗GA进行GO生物功能富集分析，用于注释基因参与的生物学过程，这21个共同靶点主要参与Regulate of response to external stimuli(调节对外部刺激的反应)、Regulation of lymphocyte proliferation(淋巴细胞增殖的调节)、Regulation of inflammatory response(炎症反应的调节)、Regulation of cytokine biosynthesis process(细胞因子生物合成过程的调控)、positive regulation of response to external stimulus(对外部刺激反应的积极调节)、positive regulation of leukocyte activation(积极调控白细胞激活)、myeloid leukocyte migration(骨髓白细胞迁移)、regulation of angiogenesis(白细胞趋化性)、cytokine-mediated signaling(血管生成的调节和细胞因子介导)的信号通路等生物学功能。

表3 虎杖-吴茱萸抗GA的 GO 生物功能富集分析比较

3.7 抗GA潜在靶点KEGG通路富集分析

表4示，对21个虎杖-吴茱萸潜在抗GA潜在靶点进行KEGG通路分析注释，21个潜在靶点主要参与Cytokine-cytokine receptor interaction(细胞因子与细胞因子受体的相互作用)、African trypanosomiasis(非洲锥虫病)、Malaria(疟疾)、 Inflammatory bowel disease (IBD) [炎性肠病(IBD)]、Rheumatoid arthritis(类风湿关节炎)、Amoebiasis(阿米巴病)、 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic Complicationsdis(IL-17信号通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信号通路)、FoxO signaling pathway(FoxO信号通路)、Jak-STAT signaling pathway(Jak-STAT)等信号通路。

表4 虎杖-吴茱萸抗GA的KEGG途径富集分析比较

3.8 动物实验结果

3.8.1 各组大鼠血清中UA和XOD水平的测定 表5示，与空白组比较，模型组UA和XOD水平明显增高(P<0.01)；与模型组比较，秋水仙碱组、虎杖-吴茱萸高、中、低各剂量组均能显著降低血清中UA及XOD水平(P<0.01)，且低、中、高剂量组呈量效关系。

3.8.2 各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17β含量测定 表5示，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-17β水平显著升高(P<0.01)，IL-10水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，秋水仙碱组、虎杖-吴茱萸高、中、低各剂量组IL-6、IL-1β、IL-17β水平含量均显著降低(P<0.01或P<0.05)，IL-10水平显著升高(P<0.01或P<0.05)。

表5 各组大鼠血清中各因子检测结果比较

4 讨论

GA是因尿酸盐沉积在关节及其周围软组织而引起的组织病损及炎性反应。尿酸钠沉积含量大或时间长，可出现关节软组织破坏和肾功能受损[1]。由于目前临床所使用的降尿酸药物品种有限，而且具有严重不良反应，因此中药在痛风辅助治疗方面的作用日渐凸显。中药虎杖和吴茱萸中的活性成分具有抗GA的作用。有研究表明，虎杖中提取出的白黎芦醇、虎杖苷、大黄素、大黄素等成分对GA都具有很好的疗效作用，能减少前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的含量，抑制关节局部细胞黏附分子-1(ICAM-1)和核转录因子-BP65(NF-BP65)的不正常表达与激活[13]。虎杖中含有的活性成分虎杖苷具有降低过高的血尿酸水平[14]；大黄素能减少尿酸合成，并促进尿酸的排泄。分子对接表明，虎杖中所含黄酮类和二苯乙烯类可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少尿酸的生成[15]；白藜芦醇可以缓解GA，减少中性粒细胞向关节腔的趋化，改善局部滑膜组织炎症浸润和增生；吴茱萸中含有的活性成分吴茱萸碱具有抗痛风、降尿酸、抗炎、镇痛等作用[16，17]。成都中医药大学附属医院院内制剂吴茱萸碱分散片在临床有很好的降尿酸作用[3]。吴茱萸碱可能通过降低模型动物 XOD活性，发挥降血尿酸水平的作用[5]。

中药化学成分复杂，作用靶点及机制不甚清楚，系统探索中药药对活性成分、作用靶点与通路间的关联性，具有重要意义。通过虎杖-吴茱萸的活性成分-靶点-疾病网络图可以发现，虎杖-吴茱萸中有8个成分的度值和9个靶点的度值大于平均度值4.64。这8个活性成分能与GA的9个或9个以上靶点相互作用。通过GO功能和KEGG通路富集分析，有细胞因子与细胞因子受体的相互作用信号通路、类风湿关节炎信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、Jak-STAT信号通路等，说明虎杖-吴茱萸抗GA具有多成分、多靶点、多通路的特点，其作用机制可能与这些通路密切相关，其中炎症相关通路及炎症因子发挥着重要作用，因此本研究通过体内药理实验对炎症相关通路及炎症因子进行了验证。

UA水平升高是痛风的生化学基础。XOD直接调控体内 UA 水平的高低，XOD活性增强会使UA的生成增加，故抑制 XOD 的活性、降低UA的生成，是治疗痛风性关节炎的重要机制[6]。动物验证实验发现，虎杖-吴茱萸各剂量组均能显著降低急性GA模型大鼠血清中UA及XOD水平，且能显著降低急性GA模型血清中IL-6、IL-1β、IL-17β含量并增加IL-10水平，说明其作用机制之一可能是通过炎症相关通路，调控相关炎症因子发挥抗GA的作用。该结果与网络药理学分析所得结果一致。

综上所述，本研究基于网络药理学预测了虎杖-吴茱萸抗GA的活性成分、作用靶点以及信号通路，其中活性成分可以调控多个靶点，关键靶点还同时调控多个重要信号通路，体现出虎杖-吴茱萸多靶点、多通路与多成分间的复杂网状相互作用关系，进而通过动物实验初步验证了虎杖-吴茱萸可通过调控炎症因子的表达发挥抗GA的作用。本项目组将以此研究为理论基础，对虎杖-吴茱萸的活性成分及抗GA的作用机制进行更为深入的研究，为虎杖-吴茱萸抗GA的临床应用及其相关产品的研发提供依据。