五子衍宗丸预防神经管畸形的机制研究❋

杨婵娟， 樊慧杰△， 柴 智， 李艳荣， 王新亮， 赵志伟， 彭 涛， 马存根,3△

(1.山西中医药大学神经生物学研究中心， 山西 晋中 030619；2.山西省中西医结合医院， 太原 030013；3.山西大同大学脑科学研究所， 山西 大同 037009)

神经管畸形(neural tube defects，NTDs)由神经管闭合不全所引起，以无脑畸形、脑膨出和颅脊柱裂为主要症状，部分可表现为无眼畸形、下肢瘫痪及二便失禁，是最严重的新生儿畸形[1]。我国是世界上已知的NTDs高发国，发病率是全球平均发病率的10倍[2，3]，有些地区甚至高达5.57‰，这给患者家庭和社会带来了无尽的痛苦和沉重的负担。叶酸(folic acid，FA)是目前国际上预防NTDs的唯一用药，将NTDs的发病率降低了60%～70%[4，5]，但这并不能阻止所有NTDs的发生。氧化应激(oxidative stress，OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡，导致体内氧化程度超出抗氧化物的清除速度，从而产生大量氧化中间产物，并引起组织和细胞损伤的一种反应[6]。OS参与各种神经变性疾病的发生发展，研究表明，几乎所有的NTDs都存在不同程度的氧化应激损伤[7，8]。

中医学认为，肾藏先天之精，为生命之本源，肾中精气具有促进生殖繁衍和促进生长发育的功能[9]。肾虚精亏是NTDs发生的基本病机。中医经典补肾方剂五子衍宗丸(wuzi yanzong pill，WYP)有补肾益精填髓的功效，可有效预防NTDs的发生。课题组研究发现，WYP可以降低NTDs发病率，且4.2 g/kg预先给药效果最佳[10]。前期采用超高液相色谱串联质谱法在WYP中未检测出FA成分，因此WYP对NTDs的预防作用与FA无关。在此基础上，本课题采用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)建立NTDs模型[11]，运用分子生物学技术研究并比较WYP与FA对NTDs的预防作用，探讨WYP预防NTDs可能的抗氧化应激机制。本研究已通过山西中医药大学实验动物伦理委员会审查，伦理学批准号2019DW020。

1 材料

1.1 动物

SPF级清洁级未经产C57BL/6小鼠36只，8～10周龄，其中雌性24只，雄性12只，平均体质量18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0006。饲养于无病原菌动物房适应性1周，繁殖期饲料喂养，动物自由进食和饮水，温度控制在(22±2)℃，相对湿度40%～60%，自然光照，通风良好。

1.2 药物

叶酸片(北京斯利安药业有限公司，批号S181112，每片0.4 mg)。将药片置于清洁的研钵中，用研杵磨成均匀的粉末，加入生理盐水使其充分溶解，配制成浓度2.44 μg/mL的FA药液，4 ℃冰箱避光储存。

五子衍宗丸以枸杞子、菟丝子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和盐车前子为原料，炼蜜为丸，由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产(批号18035041)。将药丸用中药粉碎机打成超细粉末，过筛，加生理盐水使其溶解均匀，配制成浓度为0.168 g/mL的WYP药液，4 ℃冰箱储存备用，临用前取出回温。

1.3 试剂与仪器

全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)(美国Sigma公司，批号WXBC4500V)；还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒(批号20190530)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(批号20190813)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(批号20190712)，南京建成生物工程研究所；Western blot相关抗体：过氧化氢酶(catalase，CAT)(美国Cell Signaling Technology公司，批号14097)；HRP标记的山羊抗兔二抗(爱必信(上海)生物科技有限公司，批号AS005)；BCA蛋白定量检测试剂盒(上海生工生物技术有限公司，批号F814DA0001)；RIPA蛋白裂解液(批号011918100315)、PMSF(批号061918180704)，碧云天生物技术有限公司。

EZ4D型体视显微镜(德国Leica公司)；5840型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；C-1150型酶标仪(德国Leica公司)；PowerPacTM型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；HOOD-Ⅱ型凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 NTDs模型制备

下午6时，将小鼠按雌性∶雄性=2∶1合笼交配，次日晨8时逐一检查阴道栓，将观察到有黄白色阴道分泌物的雌鼠标记并分笼喂养，当天中午12时记作孕0.5 d，未发现阴栓的雌鼠继续合笼，5 d为1个周期。按照随机数字表法将孕鼠分为正常组、模型组、FA组和WYP组4组各6只。实验组于孕7.5 d(受孕第7天中午12时)给予一次性腹腔注射atRA混悬液0.2 mL，正常组给予相应量的橄榄油。atRA混悬液(7.5 mg/kg)用无水乙醇和橄榄油按8∶92比例配制，现配现用。

2.2 给药

从检出阴道栓第0.5天起进行药物干预，持续至第11.5天。模型组和正常组给予生理盐水灌胃，FA组给予FA药液(2.44 μg/mL)，WYP组给予WYP药液(0.168 g/mL)，灌胃体积25 μL·g-1·d-1。

2.3 取材

药物干预至第11.5天脱颈处死孕鼠，用针头固定于板上。剖腹取出子宫段，于冰上剥离子宫及胎膜，将胚胎置于4 ℃生理盐水中。体视显微镜下观察胚胎，拍照、鉴定畸形并计算畸形率。正常孕鼠子宫未见充血，吸收胎较罕见，镜下观察小鼠胚胎脑泡发育完整，有胎心搏动；NTDs孕鼠子宫充血，其胚胎可出现颅脊柱裂畸形、无眼畸形、单眼畸形、面部畸形等，吸收胎多见，镜下观察其发育多不完整，且较正常胚胎发育迟缓，其中颅脊柱裂畸形胚胎未见到完整的脑泡。本文将肉眼及镜下观察到的除正常胚胎外的所有胚胎记作NTDs胚胎，将4组收集到的胚胎分别装入EP管，于-80 ℃冰箱中备用。

2.4 检测指标及方法

2.4.1 微量酶标法检测胚胎组织GSH含量 将液氮加入并浸满研钵，先取出1个组的胚胎组织将其迅速转移至研钵内，使用研杵在液氮中把组织研磨成粉末状，其余各组制法相同。将各组所得粉末一分为二，取其中一半称重，按照重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入4 ℃生理盐水，冰上研磨至均匀，高速冷冻离心机(4 ℃，2500 r/min)离心10 min，取上清液制成10%组织匀浆液，一部分检测组织浓度，其余分装备用。取以上匀浆液按照GSH试剂盒说明书步骤规范操作，酶标仪检测405 nm处各孔的吸光度值，根据测得的浓度计算组织中GSH的含量。

2.4.2 黄嘌呤氧化酶法检测胚胎组织SOD活力 取2.4.1中10%组织匀浆液，依据SOD试剂盒说明书步骤规范操作，酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值，计算胚胎组织中SOD抑制率及活力。

2.4.3 比色法检测胚胎组织GSH-Px活力 取2.4.1中10%组织匀浆液，依据GSH-Px试剂盒说明书步骤规范操作，酶标仪检测532 nm处各孔的吸光度值，计算胚胎组织中GSH-Px抑制率及活力。

2.4.4 Western blot检测胚胎组织中CAT的蛋白表达 取2.4.1中各组剩余的一半胚胎组织粉末，加RIPA、PMSF在冰上裂解提取组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各组按4∶1比例加Loading buffer制备蛋白上样缓冲液样品，用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜(恒流200 mA，2 h)，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤10 min×4次。加入抗CAT抗体(1∶1000，TBST稀释)，4 ℃冰箱过夜。洗膜并加入HRP耦联的山羊抗兔二抗(1∶5000，TBST稀释)，室温孵育2 h。膜洗净，滴加ECL化学发光液(A∶B=1∶1)，采用Bio-Rad凝胶成像分析仪检测条带，Image J 1.4软件进行灰度值比较并进行统计分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 小鼠胚胎形态学观察

图1示，胚胎正常发育良好，头颅饱满，神经管完全闭合，外形完整，色泽正常(见图1A)；神经管畸形胚胎以颅脊柱裂为主，少数可见无眼畸形、单眼畸形和面部畸形。颅脊柱神经管未闭合伴发育迟缓，形态各异，有瘀血状外观表现(见图1B)；无眼畸形胚胎：胚胎未见眼泡及眼珠，发育迟缓，呈现瘀血状外观(见图1C)。

注：A.正常胚胎；B.颅脊柱裂畸形胚胎；C.无眼畸形胚胎图1 小鼠胚胎形态学观察比较

3.2 小鼠NTDs发病率统计

图2示，与正常组比较，模型组NTDs发病率显著升高(P<0.01)；与模型组比较，FA组、WYP组NTDs发病率均显著降低(P<0.05，P<0.01)；与FA组比较，WYP组NTDs发病率明显降低(P<0.05)。结果表明，WYP与FA都可以降低NTDs发病率，且WYP的预防效果优于FA。

注：*P<0.05，**P<0.01图2 各组小鼠NTDs发病率统计比较(n=6)

3.3 WYP对NTDs小鼠胚胎组织GSH含量，SOD和GSH-Px活力的影响

图3、4示，与正常组比较，模型组GSH含量SOD、GSH-Px活力显著降低(P<0.01)；与模型组比较，FA组、WYP组GSH含量及SOD、GSH-Px活力均显著升高(P<0.05，P<0.01)；与FA组比较，WYP组GSH含量及SOD、GSH-Px活力明显升高(P<0.05)。结果表明，WYP可能增加NTDs小鼠体内抗氧化酶的含量。

注：*P<0.05，**P<0.01图3 各组小鼠胚胎组织中GSH含量差异比较(n=6)

注：*P<0.05，**P<0.01图4 各组小鼠胚胎组织中SOD、GSH-Px活力差异比较(n=6)

3.4 WYP对NTDs小鼠胚胎组织CAT蛋白的影响

图5示，Western blot结果显示，与正常组比较，模型组CAT蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，FA组、WYP组CAT表达显著升高(P<0.05，P<0.01)；与FA组比较，WYP组CAT表达明显升高(P<0.05)。结果表明，WYP组的CAT蛋白表达高于FA组。

注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01图5 各组小鼠胚胎组织中CAT蛋白表达差异比较(n=6)

4 讨论

NTDs是由胚胎发育早期神经管闭合障碍所引起的，主要影响脑和脊髓的严重先天性畸形并有多种临床表型，其中以无脑畸形和颅脊柱裂最具代表性[12]。氧化应激指机体内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成过多，或机体抗氧化能力不足，导致神经元、髓鞘等被严重破坏，是引起NTDs的一个重要因素[13]。中枢神经系统传递各种信号，其耗能多、耗氧大、ROS产生多且易积累。神经元细胞富含不饱和脂肪酸，且自身GSH含量低，易与自由基发生反应，发生过氧化损伤。有专家研究证明[14]，在诸多神经系统病变中均有ROS含量增加的现象。研究指出，使用抗氧化应激药物可以减少自由基的生成，进而减缓机体内神经元的变性和死亡[13]。因此清除过多氧化中间产物，修复氧化应激所引起的损伤，可以有效地预防NTDs的发生[15]。

NTDs的基本病机是肾虚精亏，WYP是中医补肾益精经典方，源于明代《摄生众妙方》，由枸杞子、菟丝子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和盐车前子组成，5味药均为植物种子。枸杞子、菟丝子(炒)补肾阳、益精血，共为君药；五味子(蒸)、覆盆子补肾固涩共为臣药；盐车前子泻有形之邪，利尿固精[16]。现代药理学研究表明，WYP具有抗氧化、抗炎细胞浸润、抗肿瘤及增强免疫力等作用[17]。枸杞子可以抗脂质过氧化，降低组织中丙二醛含量；五味子可以提高SOD和GSH活性，减轻活性氧自由基损害，维持细胞膜在氧化损伤状态下的稳定性；车前子具有抗氧化和清除氧自由基作用[18-20]。有研究表明，WYP维持氧化与抗氧化平衡，通过促进精子增殖治疗男性不育症[21]。

GSH和SOD是细胞内重要的抗氧化剂，能有效清除过氧化物，调节机体氧自由基代谢，发挥抗氧化作用[22，23]。CAT和GSH-Px是过氧化物分解酶，能将有毒的过氧化物催化成无毒的羟基化合物，使细胞膜结构保持完整，功能不受损害[24]。本研究结果显示，WYP和FA都可以降低小鼠NTDs的发生率，增加GSH含量，提高SOD和GSH-Px的活力，上调CAT表达水平，且WYP的预防效果明显优于 FA。

综上所述，WYP能显著降低小鼠NTDs的发病率，有效预防NTDs的发生，其作用机制可能是WYP激活小鼠体内抗氧化功能，减弱脂质过氧化程度，清除过氧化产物，阻止自由基的入侵，从而对抗氧化应激。本课题为WYP预防NTDs运用于临床提供了实验依据。