菜薹和芥蓝种间杂交胚挽救技术研究

吕凤仙，李崇娟，杨 鼎，胡靖锋，杨红丽，兰 梅，徐学忠，张丽琴，和江明 ，董相书

（1. 云南大学, 云南 昆明 650504；2. 云南省农业科学院园艺作物研究所, 云南 昆明 650205；3. 国家蔬菜改良分中心云南分中心, 云南 昆明 650205）

0 引言

【研究意义】菜薹（俗称菜心，Brassica campestrisL., AA, 2n=20），和 芥 蓝（Brassica albograbraL. H. Bailey, CC, 2n=18）均属十字花科芸薹属中不同种的重要薹用蔬菜。菜薹是由易抽薹白菜类蔬菜材料，经过长期选育而来的[1]。芥蓝在我国的栽培历史悠久，但是遗传育种的研究较为薄弱[2]，生产上推广应用的品种普遍存在产量低、品质差、病虫害严重等问题[3]。由于二者种质资源相对较少，遗传背景狭窄，单靠种内杂交，很难在现有基础上取得突破性进展。通过种间杂交，可以创制新品种，获得有用的育种材料。但二者存在杂交不亲和，不能得到后代，需采用人工胚挽救等方法才能获得菜薹和芥蓝种间杂交的后代。【前人研究进展】通过远缘杂交，可以创造新的杂种优势和新物种、新材料，但远缘杂交过程中存在诸多生殖障碍。邱德勃等[4]在芸薹属和萝卜属植物的远缘杂交中发现，胚乳在发育过程中解体，导致远缘杂种胚的败育，是受精后不亲和以及无法形成成熟种子的主要原因，Chrungu[5]研究发现，幼胚的离体培养是克服不亲和性的有效途径。梁红[6]对菜薹与甘蓝正反交，通过杂种胚离体培养，获得杂交优势显著的种间杂种。满红[7]以二倍体菜薹、四倍体菜薹、二倍体芥蓝、四倍体芥蓝为材料，经人工授粉杂交，通过子房培养和胚珠培养，创建了菜薹和芥蓝的种间异源四倍体和异源三倍体种质。乔海云[8]以菜薹和芥蓝为试验材料，运用蕾期授粉结合胚挽救技术获得菜薹与芥菜的种间杂种，为芸薹种和甘蓝种种质创新和遗传研究奠定基础。魏晓云等[9]采用二倍体菜薹和二倍体芥蓝杂交，筛选出亲和性较高的材料。【本研究切入点】前人的研究中虽已经获得菜薹和芥蓝的种间杂种，但对菜薹和芥蓝种间杂种胚挽救过程中，培养基成分、取材时间等细节进行筛选的研究有待深入进行。本试验通过对菜薹和芥蓝种间杂种胚挽救各个过程进行详细研究，以提高种间杂种的获得率。【拟解决的关键问题】通过设置不同的取材时间，不同生长调节剂配比，不同培养基成分，利用出胚率、增殖系数、生根率、生根时间等指标对各设定进行评估，筛选出最适合菜薹×芥蓝种间杂种胚挽救的实验方案，为菜薹和芥蓝育种种质的创制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料菜薹CX20000和芥蓝JL20000均由云南省农业科学院园艺所十字花科课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种间杂交 试验材料于2020年6月1日播种，7月8日定植于云南省农业科学院十字花科课题实验基地塑料大棚内，常规栽培管理，菜薹于种间杂交。于杂交前2 d摘除父母本花序上已开放花朵，并套袋隔离，套袋父母本开花当天，对菜薹套袋分枝上未开放且未露柱头的花蕾进行剥蕾去雄，授以芥蓝套袋分枝上当日开放的花粉，配制CX20000×JL20000杂交组合，授粉后套袋隔离，严防父本以外的花粉污染。

1.2.2 不同培养方式 人工去雄授粉后，于适宜时间，取部分杂交后胚珠进行胚挽救培养，留取一部分在植株上继续生长，进行常规培养，比较两种方式的出胚率。

1.2.3 不同胚挽救培养基 大田授粉后，于授粉后第12天，选取有明显膨大胚珠的子房，用自来水冲洗2～3遍，于超净工作台内用75%酒精浸泡50 s，将酒精倒出后用10%次氯酸钠浸泡15 min，接着用无菌水冲洗3次，最后用无菌水浸泡3 min。用解剖刀沿子房腹缝线和背缝线处轻轻切开，用镊子挑取饱满且呈绿色的胚珠，分别接种到ERM1、ERM2、ERM3、ERM4、ERM5、ERM6、ERM7、ERM8培养基上（表1），每种培养基均设置3次重复，每次重复接种25～35个胚珠，接种后胚珠在温度（25±2） ℃、光照12 h·d-1、光照强度1500 lx的条件下培养[8]。接种1周后进行观察，30 d后统计出胚率，筛选适合的胚挽救培养基。

表1 菜薹×芥蓝种间杂种胚挽救培养基成分Table 1 Components in embryo rescue medium for interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

1.2.4 不同取材时间 大田授粉后，分别于授粉后10、11、12、13、14、15 d，选取有明显膨大胚珠的子房，消毒、灭菌后，挑取饱满且呈绿色的胚珠，接种到ERM4培养基上，每个取材时间设置3次重复，每次重复接种30～130个胚珠，接种后胚珠在温度（25±2）℃、光照12 h·d-1、光照强度1500 lx的条件下培养1周后进行观察，30 d后统计出胚率，观察不同取材时间出胚率，筛选最适宜的取材时间。

1.2.5 不同增殖培养基 成活并成功分化的胚珠分别转移至DM1、DM2、DM3、DM4培养基上进行增殖分化（表2），每种培养基设置3次重复，每次重复接种25-27个不定芽，观察增殖情况，并统计各培养基的增殖系数，筛选适宜的增殖培养基。

表2 菜薹×芥蓝种间杂种增殖培养基成分Table 2 Components in propagation medium for interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

1.2.6 不同生根培养基 胚珠在增殖培养基上分化至具有完整植株形态后，转接至1/2MS培养基上继续培养，长至3对真叶后，转移至生长素种类和质量浓度不同的RM培养基（表3），每种培养基设置3次重复，每次重复接种8～16株幼苗，观察统计各培养基的生根情况。根长适宜的幼苗定植于含育苗基质的苗钵后，在温度20～25 ℃，湿度80%条件下进行炼苗，待幼苗生长情况稳定后，移栽至红土∶过筛腐殖土=1∶1比例混合土内，常规肥水管理。定植后的杂种植株，统计其成活率。结合生根情况与幼苗成活率，筛选最适宜的生根培养基。

表3 菜薹×芥蓝种间杂种生根培养基成分Table 3 Components in rooting medium for interspecific B.campestris × B. albograbra hybrids

1.3 种间杂种形态学鉴定

成活后的杂种植株，在正当繁茂时观察其叶形、叶色、叶表面特征、花器官的颜色大小等方性状，并分别与菜薹和芥蓝两亲本进行比较，鉴定杂种的真实性。

1.4 数据分析

利用SPSS23.0软件对试验数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 胚挽救和常规培养的比较

菜薹×芥蓝种间杂交后，在母本植株上自然生长进行常规培养，获得种子数为0，而胚挽救培养成功获得了种间杂种植株，证明菜薹×芥蓝种间杂交后代不结籽，需通过人工胚挽救培养，才能成功获得杂种。

2.2 不同培养基成分对出胚的影响

不同成分培养基出胚率如表4所示，共接种杂种胚珠730粒，出胚总数75粒，其中未添加生长调节剂的ERM1培养基上，未见胚珠萌发；ERM2和ERM3胚珠萌发率较低，分别为1.33%和2.56%，且差异不显著；ERM4培养基上出胚率显著高于其他培养基，为26.32%；ERM5、ERM6、ERM7、ERM8培养基随着添加的6-BA浓度逐渐增大，出胚率从18.18%逐渐降低至7.77%；因此ERM4（MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1）出胚率最高，为最佳胚挽救培养基。萌发后的杂种胚均生长良好，接种20 d后出胚情况、40 d后成苗情况、成活胚珠增殖情况均如图1所示。

图1 菜薹×芥蓝种间杂种胚挽救情况Fig. 1 Embryo rescue of interspecific B. campestris × B.albograbra hybrids

表4 菜薹×芥蓝杂种胚珠在不同培养基上出胚率Table 4 Embryogenesis rate of B. campestris × B. albograbra hybrid ovules on different media

2.3 不同取材时间对出胚的影响

如表5所示，不同取材时间的胚珠，在ERM4培养基上出胚率均存在差异，授粉后第10天取材，由于胚珠过小，依赖母体而离体培养很难成活，胚珠萌发率只有4.44%；授粉后第12天取材出胚率最高，为26.32%，且与其他取材时间相比差异显著；授粉12天以后取材，由于杂种胚逐渐败育，出胚率逐渐减小，第15天仅有3.33%。因此授粉后第12天为菜薹×芥蓝杂种胚最适宜的取材时间。

表5 菜薹×芥蓝不同取材时间杂种胚珠出胚率Table 5 Embryogenesis rate of B. campestris × B. albograbra hybrid ovules with differed sampling time

2.4 不同增殖培养基的增殖效果

从表6可见，不同培养基增殖效果不同，增殖系数越大，增殖分化效果越好。DM1增殖系数为5.37，显著高于其他培养基；DM2和DM3增殖系数无显著差异，分别为4.02、4.15；DM4的增殖系数显著小于其他培养基，为2.90。因此DM1（MS+ 6-BA 0.9 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1）为菜薹×芥蓝种间杂种的最佳增殖培养基。

表6 菜薹×芥蓝种间杂种成活胚珠在不同培养基上增殖分化情况Table 6 Proliferation and differentiation of viable ovules in B.campestris × B. albograbra hybrids on different media

2.5 不同生根培养基对生根效果的影响

从表7可知，以不同基本培养基，添加不同种类和不同浓度生长素，生根效果均存在差异。生根率方面，最高的为RM4-1和RM1-1，分别为44.44%和40.74%，二者相比无显著差异，但显著高于其他培养基；其次是RM4-2，为37.21%，与RM1-1差异不显著。生根时间方面，RM4-2平均生根时间为8.33 d，生根最快，且与其他培养基平均生根时间差异显著。在不同培养基上成功生根后的幼苗，经炼苗、移栽后，均未出现死苗现象，幼苗移栽成活率为100%。

表7 菜薹×芥蓝种间杂种不同培养基生根情况Table 7 Rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids on different media

从图2可知，添加不同种类生长素，诱导的根形态也存在差异，添加NAA培养基，幼苗生长的根，表现为短且粗壮、无须根，添加IBA和IAA诱导的根，表现为细长。以MS培养基为基本培养基时，各培养基均出现部分苗产生盐害的现象（图3），盐害苗叶片部分黄化且逐渐脱落，将MS培养基更换为1/2MS培养基时，这一现象得到缓解（图4）。综上所述，幼苗移栽成活率未受不同生根培养基影响，RM4-1、RM1-1和RM4-2的生根率较高，RM4-1和RM4-2培养基上生长的幼苗质量较高，RM4-2生根时间最短，生根最快，适用于组培苗的快速繁殖，因此RM4-2（1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1）为菜薹×芥蓝种间杂种胚挽救幼苗的最佳生根培养基。

图2 菜薹×芥蓝种间杂种生根过程不同生长素生长果Fig. 2 Effects of auxins on growth during rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

图3 菜薹×芥蓝种间杂种生根过程盐害现象Fig. 3 Damage induced by salt at rooting stage of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

图4 菜薹×芥蓝种间杂种生根过程Fig. 4 Rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

2.6 种间杂种形态学表现

对菜薹×芥蓝种间杂种进行形态学观察并与菜薹和芥蓝各性状进行比较。以菜薹作为母本的种间杂种植株，植株形态如图5所示，主薹表面有棱，叶片形状为长卵圆，叶片颜色为深绿，与母本菜薹更为接近，主薹的颜色为浅绿，且有少量蜡粉，与父本芥蓝更为接近。杂种植株花器官形态如图6所示，花朵颜色与父本相同，为白色，花朵大小介于父母本之间。综合上述形态学表现，初步判断所得植株为菜薹和芥蓝种间杂交所得真杂种。

图5 菜薹×芥蓝种间杂种植株形态Fig. 5 Morphology of interspecific B. campestris × B.albograbra hybrid plant

图6 菜薹×芥蓝种间杂种花器官形态Fig. 6 Morphology of floral organ of interspecific B.campestris × B. albograbra hybrid

3 讨论与结论

影响杂交亲和性的因素主要包括杂交组合方式和亲本的基因型[10]，而亲缘关系越近的两种植物杂交，越容易获得成功[11]。刘爱华[12]、栗茂腾[13]、李宗芸[14]、宋运淳[15]等学者的研究结果都表明芸薹属A和C基因组较A和B以及B和C之间亲缘关系较近，本试验进行远缘杂交的两亲本作物菜薹和芥蓝，分别为芸薹属A组和C组染色体中的重要薹用蔬菜，成功获得了菜薹×芥蓝的种间杂种。李明山[16]、张国庆[17]等学者的研究结果表明，胚挽救技术能够克服杂交的不亲和性，本试验中进行的种间杂交常规培养无法获得种子，采用胚挽救技术获得了杂交种，证明胚挽救技术能克服杂交不亲和性的困难。

受父母本基因型的影响，授粉后的不同时间胚珠发育程度不同，谭亚飞[18]利用白菜型油菜黄籽沙逊和芥蓝进行种间杂交，胚挽救实验结果表明授粉后第11天为最佳取材时间，出胚率最高。而本试验中，受母本菜薹影响，最佳取材时间为授粉后第12天。Harberd[19]在甘蓝×白菜的杂交研究中发现，取材时间和培养基种类都会影响胚挽救技术的结果。满红[7]对四倍体菜薹和四倍体芥蓝的种间杂种进行子房培养，最佳的取材时间为授粉后7 d，得胚率为1.53个胚珠/子房。本试验中授粉后10～15 d取材，进行胚珠培养，每个取材时间的出胚率各不相同，且授粉后第12天出胚率最高，为26.32%，而菜薹×芥蓝的胚珠，在5种不同的培养基上萌发情况也不同，以ERM4培养基（MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1）萌发率最好，出胚率为26.32%，显著高于其他培养基。

植物根系的形成与诸多因素有关，植物生长调节剂起着关键作用[20]，当生长调节剂浓度高于细胞分裂素时，有利于不定根的诱导。本试验中在1/2MS和MS中分别添加不同浓度的NAA、 IBA和IAA，试验数据表明，以RM4-1（1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1）生根率最高，高于添加IBA和IAA的培养基。这一结果与张以忠[21]的 IAA与IBA诱导荞麦生根的效应好于NAA有差异，但与王健省[22]的NAA对双瓣茉莉水培扦插生根的效果明显优于IAA一致，据吴大忠[23]的研究结果表明，不同的无性系生根所需的生长调节剂种类和浓度存在较大的差异，可能是不同植物诱导生根适宜的生长调节剂种类不同。另外，本试验通过添加不同浓度生长调节剂诱导生根发现，RM4-2（1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1）诱导生根最快，适宜进行快繁，实际应用中应根据具体需求，选择适宜的生根培养基成分。

本研究筛选出了适宜菜薹和芥蓝种间杂种的胚挽救实验方案，为种间杂种的选育奠定了基础。但通过此试验获得的杂交种为异源二倍体，减数分裂时染色体无法正常联会配对，从而无法形成配子，不具有育性，要得到能正常繁殖的杂交种，还需进行人工加倍等试验，克服种间杂种的不育性，选育出具有杂种优势的种间杂种。