IL-33/ST2轴在急性脑梗死大鼠炎性损伤中的作用①

王耀坤，陈 颖，聂姗姗，邱梓峰，杜云婷

(1.佳木斯大学医学部，黑龙江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；3. 中国医科大学肿瘤医院，辽宁省肿瘤医院检验科，辽宁 沈阳 110042)

急性脑梗死是由脑动脉凝血引起的，导致脑氧缺乏和脑梗死。由炎症引起的缺血性脑组织坏死是其主要病理损伤机制，是脑卒中患者高致残率和致死率的主要原因之一。在我国脑血管病已在各种死亡原因中上升为第一位[1]，其致病机制是一种炎症过程，涉及内皮活化，血脑屏障破坏，氧化剂和炎症介质积聚，以及白细胞和血小板的大量趋化和聚集[2]。人们普遍认为炎症与脑缺血性损伤的发病机制有关。炎症因子和抗炎因子之间的平衡显著影响脑梗死患者预后。

白细胞介素-33(IL-33)是白细胞介素-1超家族新发现成员之一，在人和小鼠中通过促炎性刺激后由多种器官和细胞类型表达[3]。IL-33与其受体ST2组成的信号通路(即IL-33/ST2 信号通路)在Th2介导的相关免疫反应中发挥重要作用[4,5]。IL-33与许多炎症性疾病相关，如哮喘类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病和中枢神经系统(CNS)疾病[6]。有研究表明，IL-33可能与急性脑梗死的发病机制有关[7]。本研究旨在探索IL-33/ST2信号通路在急性脑梗死发生发展过程中的作用。旨在为临床应用IL-33早期诊断和治疗急性脑梗死患者的炎症反应提供必要的实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂：BCA 蛋白定量试剂盒(BOSTER，Prod：AR0146)，兔抗鼠β-Actin 单克隆抗体(Cell signaling，13E5)，兔抗鼠IL-33单克隆体抗(Santa Cruz, CA, USA)，兔抗鼠ST2单克隆抗体(Santa Cruz, CA, USA)。IL-5、IL-13酶联免疫分析试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)anti-CD4+-FITC、anti-IL-4+-PE(BD Biosciences, USA)，蛋白裂解液(V900854-100ML)，固定破膜剂(eBioscience)，刺激物(PMA+离子霉素+蛋白转运抑制剂)，流式细胞仪FACSCalibur(BD Biosciences, USA)。

1.1.2 实验动物分组及模型制备：清洁级8～10周龄的雄性SD大鼠，体重250～300g，共30只，均购自哈尔滨医科大学。随机分为两组，急性脑梗死大鼠出血24h(MCAO-24h)组和假手术组(Sham)，5只/组，实验共进行3次。大鼠急性脑梗死模型构建：利用改良线栓法[8]通过手术制备大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。假手术组(Sham)仅分离双侧颈总动脉及剥离迷走神经，随即缝合切口。手术组(MCAO)在术后24h按照Bederon[8]法进行评分，>3分为合格模型。

1.2 方法

1.2.1 Western-blot检测大鼠脑组织中IL-33和ST2蛋白表达水平：大鼠颈椎脱位处死，取出大脑后用PBS冲洗掉血液，脑组织剪碎后置于10mL离心管中，加入蛋白裂解液5mL，均浆后4℃裂解2h，4℃ 10000g 离心30min，取上清，用BCA 法测定蛋白浓度， -80℃保存。50μg的蛋白总量上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，一般采用恒压浓缩胶50v，60min分离胶80v，1h45min左右。电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。转膜60v，1h40min后5%脱脂奶粉室温下封闭1h，分别加IL-33 (1:1000)、ST2(1:1000) 和β-actin抗体，4℃孵育过夜，第2天1:10000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，常温，缓慢摇晃1h ，ECL化学发光法显影。采用 Image-J 图像分析软件，计算各指标相对于内参的相对吸光度值。

1.2.2 ELISA检测大鼠脾细胞上清IL-5和IL-13水平：MCAO-24h、sham组大鼠。实验操作按照试剂盒说明书进行，每孔加入上清液50μL ，37℃孵育120min，PBST反复洗涤3次；加入酶结合物100μL，37℃孵育60min；PBST反复洗涤3次，每孔加入显色剂100μL，避光显色30min，每孔加入终止液100μL；使用酶标仪测定450nm处OD值，应用SoftMax Pro 4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 流式细胞术检测大鼠脾脏中Th1/Th2细胞数：将大鼠脾脏取出研磨，加入红细胞裂解液，用3%FCS液洗涤3次，取流式管，编号阴性对照管、三个单阳补偿管和样本管；阴性对照管中加入3种同型对照抗体各2μL。3个单阳补偿管分别加入2μL anti-CD4-FITC、2μL anti-IL-4-PE和2μL anti-IFN-γ-APC的流式抗体；100μL裂解后外周血表面标记anti-CD4-FITC，4℃避光孵育30min，3% FCS液洗涤后加入破膜剂，混匀后4℃避光60min，然后加入2μL anti-IL-4-PE和anti-IFN-γ-APC，室温孵育30min，流式细胞仪计数并分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠脑组织中IL33/ST2蛋白表达水平变化

与假手术组(Sham)相比，急性脑梗死大鼠出血24h(MCAO-24h)组脑组织中IL/33蛋白含量减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，ST2蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：与Sham组比较， *P<0.05。

2.2 大鼠脾细胞上清中细胞因子IL-5和IL-13水平

与假手术组(Sham)相比，急性脑梗死大鼠出血24h(MCAO-24h)组大鼠脾上清中IL-5和IL-13含量明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：与Sham组比较， *P<0.05。

2.3 大鼠脾脏中Th2细胞数变化

与假手术组(Sham)相比，急性脑梗死大鼠出血24h(MCAO-24h)组脾脏中，Th2型细胞IL-4+in CD4+T细胞百分数减低，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-4+in CD4+T细胞百分数和绝对数显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，Th1型细胞IFN-γ+ in CD4+T细胞百分数，差异有统计学意义(P<0.05)。绝对数明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

注：与Sham组比较， *P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

脑梗死的发病机制非常复杂，当血栓栓子影响大脑血运时，就会发生急性脑梗死。其机制一般认为是血管壁内皮的损伤，同时大量中性粒细胞的趋化作用，氧化应激反应进一步损伤血管内皮的完整性进而导致脑血管血流动力学的改变[7]。前炎症反应和免疫应答在急性脑梗死中发挥重要作用，T细胞亚群表型和功能失衡是许多炎症相关性疾病发生发展的病理生理学基础[9]。

IL-33 的受体是 ST2，其有四种亚型 ST2L、sST2、ST2V 和 ST2LV。ST2L通过胞外段与 IL-33 结合，启动胞内信号转导并发挥作用。ST2L主要表达于Th2 细胞、肥大细胞，以及嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞等。IL33/ST2主要促进Th2淋巴细胞和新发现的2型先天性淋巴细胞(ILC2)分泌Th2型细胞因子IL-5、 IL-13及抑制性细胞因子IL-10[5]。体外实验表明，IL-33与IL-4协同作用驱动巨噬细胞(M2)的极化，同时分泌高水平的IL-10和TGF-β[10]。在中枢神经系统中，IL-33在脑内皮细胞和星形胶质细胞表达，LPS通过星形胶质细胞上调IL-33的表达[11]。最近的研究表明，IL-33在脑损伤后迅速从中枢神经系统细胞中释放出来，并有助于病变区域内免疫应答的激活[12]。同时，血清中的IL-33已经成为急性脑梗死的生物学指标[13]。本实验中，在急性脑梗死24h后大鼠脑组织中的IL-33和ST2蛋白含量显著降低，因此我们推测急性脑梗死是通过IL-33/ST2信号通路影响脑组织中IL-33的含量。在动物实验中，大脑中的IL-33可以通过平衡Th1/Th2来改善缺血性脑损伤，有利于Th2免疫应答并抑制小鼠的Th17反应，表明IL-33对急性脑损伤具有保护作用[14]。在人类急性脑梗死病例中，血清中IL-33的水平与急性脑损伤的梗死范围成正相关，表明 IL-33可能参与了调节脑梗死的炎症反应，参与其免疫应答[7]。研究表明，急性脑梗死患者在3个月时血清中高水平IL-33患者具有较好的结局，提示IL-33可能是一种抗炎因子，可以预测急性脑梗死的预后[7]。本实验中，我们检测大鼠脾上清中IL-33 /ST2轴的下游细胞因子IL-5和IL-13，不难发现急性脑梗死24h后，脾细胞分泌的 Th2型细胞因子IL-5和IL-13显著降低，抗炎性因子的降低可能对急性脑梗死的预后有重要影响。同时，通过流式细胞术检测大鼠脾脏Th1和Th2型细胞的百分比，结果表明急性脑梗死24h后，Th2型表面分子IL-4+in CD4+T细胞百分比明显降低，而Th1型表面分子IFN-γ+ in CD4+T细胞百分比明显升高，这可能与Th1/Th2免疫应答平衡的机制相关。

综上所述，急性脑梗死激活前炎症反应，Th1应答增强，抑制 Th2型免疫应答和抗炎性细胞因子的分泌。这些结果表明，IL-33和ST2均可以作为急性脑梗死诊断和预后的标志物，同时IL-33/ST2轴潜在的免疫调节机制对急性脑梗死的病理生理和抗炎作用有重要意义。