人源大麻素受体的结构生物学研究

沈灵，华甜†，刘志杰††

①上海科技大学 iHuman研究所，上海 201210；② 上海科技大学 生命科学与技术学院，上海 201210

1 大麻及大麻素

大麻隶属于植物界的被子植物门双子叶植物纲荨麻目桑科大麻属。在没有被人类广泛使用前，大麻主要分布于印度、不丹和中亚细亚，目前在很多国家和地区均可以合法种植。大麻在医药、宗教、灵学和娱乐等领域均有较长的使用历史，是一种在人类早期就开始种植的物种。据史料记载，大麻这一古老的药用植物从公元200年前就一直作为治疗多种疾病的植物药使用[1]。

大麻/大麻素（marijuana/cannabinoid）在20世纪中后期就已经成为主流科学的研究目标，国际上很多科研机构均开始了对大麻素作用机制和药用价值的研究。大麻中含有上百种活性化合物，这些化合物被统称为植物性大麻素。其中的主要成分包括具有精神活性的四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol, THC）[2]和非精神活性的大麻二酚（cannabidiol, CBD）等。由于THC可以使人成瘾，联合国公约和许多国家的法律均把大麻列为“麻醉品”或“毒品”，对大麻的态度基本是采取限制、管制和监察的措施。研究显示，人类摄入THC含量小于0.3%不显示精神活性，可以作为工业大麻添加使用，但是摄入THC含量大于0.3%则具有一定的药用和滥用倾向[3-4]。因此，出于安全因素考虑，近年来各国普遍采用欧盟（农业）委员会制定的统一标准，即控制工业大麻原料干品的THC含量小于0.3%。目前大麻在现代医学中的重要作用已经得到更加广泛的研究和认可，THC和CBD在国外已被广泛应用于医药研究中。例如，2018年分别被欧盟EMA和美国FDA批准上市治疗儿童癫痫病的新药“Epidiolex”中的主要有效成分就是大麻中的CBD。

与大麻素相关的化合物是一类结构和功能多样的化学物质，具体可分为以下三个大类（表1）。①植物性大麻素：从植物大麻中提取，具有可令人产生亢奋、幻觉及愉悦感的THC等。我国早期的药书《本草纲目》和《神农本草经》[5]中就有关于植物性大麻素的医药和保健用途的大量记载，包括用其治疗便秘、疟疾和疼痛等。 在20世纪40年代，Todd和Adams分离出了一种具有弱神经作用的成分CBD[6-7]，从此对大麻的研究才真正开始。但是直到1964年，科学家才首次分离和合成出大麻的主要活性成分THC，为之后化学家设计结构类似物及新型合成类大麻素提供了分子基础。②内源性大麻素：由生物体内自身合成产生，主要是一些酰胺、脂类，或细胞膜表面的脂质前体被某些酶催化加工后的脂类化合物[8]。它们均具有与植物性大麻素THC相似的三维结构。③合成型大麻素：由实验室或者工业合成，具有植物性大麻素和内源性大麻素的部分或全部生理特性，是天然大麻素的辅品或者替代品。一些合成型大麻素对大麻素受体的激活或拮抗能力比天然大麻素强4～5倍，甚至可以高百倍以上。因此这些合成型大麻素和天然大麻素相比会对人体的一些生理系统与器官，如神经系统、消化系统（肠胃）、心血管系统等有毒副作用[9]。但是，天然及合成大麻素如果严格按照药物评价的标准流程进行研发，那么它们在治疗疼痛、抑郁症、癫痫症、焦虑、癌症、免疫类相关疾病，以及肥胖症等方面具有较好的应用前景。

表1 经典大麻素的有效成分以及功能简介

2 内源性大麻素系统

内源性大麻素系统（endocannabinoid system,ECS/eCBs）在人体内广泛分布，主要由内源性大麻素N-花生四烯酸乙醇胺（anandamine,AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol, 2-AG），以及与它们相互作用的受体和负责合成代谢及降解内源性大麻素的酶（fatty acid amide hydrolase, FAAH; monoacylglycerol lipase, MAGL）所组成[10]。ECS在整个大脑中的表达方式多种多样，它们涉及神经传递、记忆形成和炎症反应的调节和微调，同时在神经发育中起关键作用。在神经通路、神经元或者其他类型的细胞中，这些小分子、酶或者一至两种大麻素受体共同作用形成的ECS，可以发挥不同的生理功能[11]，其中包括学习、记忆、炎症、食欲、消化、能量平衡、代谢、睡眠周期、压力、情绪和成瘾等[12]，因此ECS中的很多重要组分均是潜在的药物靶点。

3 大麻素受体CB1和CB2及其信号转导通路

目前已知的大麻素受体（cannabinoid receptor）属于G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）中的Class A家族，主要包括大麻素受体亚型I（cannabinoid receptor type 1, CB1）和大麻素受体亚型II（cannabinoid receptor type 2, CB2）。CB1和CB2具有44%的序列同源性[13]，其中CB1主要分布在脑区的大脑皮层、海马、小脑和基底核等[14]，同时在脊髓和外周神经系统中也有少量分布，所以CB1又被称为中枢型大麻素受体。它的激活可以降低神经递质的释放，例如多巴胺，进而参与调节认知、记忆和运动控制等。CB2则主要在外周免疫系统高表达，例如扁桃体、胸腺免疫细胞和脾脏边缘区等，所以CB2又被称为外周型大麻素受体，在调节免疫系统内外因子的释放和免疫性细胞的迁徙中发挥重要作用[15]。CB1和CB2均可调节化学递质的释放，不过CB1的主要来源是神经细胞，CB2则来源于免疫细胞。

大麻素受体CB1和CB2主要通过与G蛋白Gi/o亚型偶联进行下游信号转导。当受体结合激动剂后，会抑制腺苷酸环化酶的活性，导致细胞内的环化腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）降低[16]。CB1在某些特定条件下，激动剂与受体结合后，也会与G蛋白Gs[17]或者Gq[18]亚型偶联并介导下游信号传递。近年来的研究表明，大麻素受体CB1和CB2也可以通过阻遏蛋白（arrestin）介导下游信号转导，广泛地参与多种细胞生理活动，调节与G蛋白不同的生理功能。大麻素受体介导的信号通路与很多疾病的发生和发展紧密相关，因此是非常重要的药物靶点[19]。

4 大麻素受体CB1的结构研究进展

人源大麻素受体CB1于1990年被成功克隆，由472个氨基酸组成，属于GPCR Class A家族的α分支。2016年，第一个CB1与拮抗剂AM6538复合物的2.8 Å（1 Å = 10-10m）晶体结构被成功解析[20], 随后CB1与拮抗剂Taranabant的三维结构也得到解析[21]。CB1与AM6538及CB1与Taranabant复合物的三维精细结构揭示了受体的重要结构特征以及与拮抗剂结合的关键相互作用（图1（a、b））。整体结构显示，CB1具有GPCR典型的七次跨膜结构，由胞内3个loop（ICLs）和胞外3个loop（ECLs）以及第8个螺旋（Helix 8）组成。CB1的N端构象比较特殊，在拮抗剂配体的识别中起到了关键作用。具体而言，CB1的N端（99～112）氨基酸残基形成V型环并从垂直于细胞膜方向插入CB1的结合口袋，像一个塞子将结合口袋封闭。在已解析的与CB1同源性较高的脂类受体S1P1[22-23]（sphingosine-1-phosphate receptor 1）和LPA1（lysophosphatidic acid receptor 1）[24]中，它们的N端也形成有序的螺旋构象并从上方将结合口袋封闭，从而形成疏水的配体结合口袋，有利于配体的结合。之前的研究论文表明CB1的胞外第二个环（ ECL2）在蛋白表达、功能以及配体结合方面都非常重要[25]。CB1的晶体结构中显示由21个氨基酸组成的ECL2折叠形成复杂结构，其中有4个氨基酸（268～271）插入结合口袋中。据报道，这4个氨基端对于介导某些特定配体的相互作用至关重要，而ECL2中的两个半胱氨酸（Cys257、Cys264）形成的二硫键约束了整个ECL2的构象。

2017年Nature杂志发表了CB1分别与两种新型激动剂小分子AM11542和AM841复合物的三维精细结构[26]（图1（c、d））。该结构不仅揭示了激动剂小分子与CB1的相互作用模式，更重要的是，与之前解析的CB1-AM6538复合物的结构相比，CB1在激动剂小分子的调控下发生了很大的构象变化。CB1的N端以及七次跨膜螺旋的构象变化幅度在以往解析的GPCR结构中是最大的。同时，结合口袋体积发生了约53%的变化（激动剂的结合口袋体积为383 Å3，拮抗剂的结合口袋体积为821 Å3）。这些结构特征也从分子水平解释了为什么CB1可以与多种不同类型的配体相互作用，参与和调控人体中很多非常重要的生理活动。CB1与激动剂复合物结构揭示的另一重要发现是，首次从三维结构上观测到两个氨基酸（Phe2003.36/Trp3566.48）在CB1激活过程中的协同构象变化，共同启动CB1的激活过程，被称之为“双耦合开关”（twin toggle switch）。在此之前，人们观测到的GPCR激活大多只需要一个氨基酸Trp6.48参与。CB1的“双耦合开关”可能与其特殊的激活机制密切相关。

近年来随着冷冻电镜技术的突破，GPCR和下游信号转导蛋白复合物的结构也得到了解析。2019年Krishna等人[27]解析了基于吲哚合成的大麻素MDMB-Fubinaca（FUB）结合的CB1-Gi的复合物结构，揭示了吲哚类激动剂对CB1的激活机制以及与G蛋白的相互作用模式（图1（e））。但是基于THC衍生物的激动剂是如何激活CB1受体以及与G蛋白的偶联机制仍然不是很清楚。2020年在Cell杂志上发表的CB1-AM841-Gi的结构有进一步描述和解释[28]。如图1（f）所示，CB1-AM841-Gi的总体结构类似于我们之前解析的与AM841结合的CB1晶体结构[26]，主要差异发生在CB1和G蛋白界面上，其中相互作用残基由Gi稳定，同时TM5的延长和TM5、TM6、ICL1和ICL2在细胞区域里的向内运动导致与Gαi蛋白结合的α5发生更多的极性和疏水相互作用[28]，而且在晶体结构中我们提到的双耦合开关依旧在复合物结构中呈现打开的状态，可见它们在CB1的激活过程中非常重要。

已经获得的多种CB1结构（非活性状态、激动剂结合的类活化状态和活化状态）揭示了重要的构象多样性，并为我们提供了解密大麻素受体激活和信号转导机制的结构基础，可以看出CB1在不同状态之间的过渡过程中具有可塑性，揭示了CB1能够结合不同类型配体的分子理论依据。

5 大麻素受体CB2的结构研究进展

图2 大麻素受体CB2与不同配体复合物的三维结构：（a）CB2-AM10257晶体结构（粉色螺旋表示CB2，粉色球棍状表示AM10257）；（b）CB2-AM12033晶体结构（蓝绿色螺旋表示CB2，蓝绿色球棍状表示AM12033）；（c）CB2-AM12033-Gi复合物电镜结构（绿色螺旋表示CB2，绿色球棍状表示AM12033，黄色表示Gαi亚基，青色表示Gβ亚基，粉色表示Gγ亚基）；（d）CB2-WIN-55,212-2-Gi复合物电镜结构（紫色螺旋表示CB2，紫色球棍状表示WIN-55,212-2，橙色表示Gαi亚基，青色表示Gβ亚基，粉色表示Gγ亚基）

Munro等人[15]于1993年首次从HL60细胞中克隆出大麻素受体CB2基因。CB2主要在免疫系统中表达，近几年人们逐渐认识到CB2在免疫调节、炎症、神经性疼痛、神经炎和神经退行性疾病治疗中的潜在作用。人源大麻素受体CB2与拮抗剂复合物的结构于2019年首次获得解析[29]（图2（a）），2.8 Å分辨率的晶体结构清晰地揭示了CB2与拮抗剂AM10257的相互作用模式。研究者通过与CB1三维结构的对比分析，发现同处于拮抗状态下的CB2与CB1结构差别很大。两个受体靠近胞内的跨膜区结构均为收紧的状态，但是靠近胞外的跨膜区包括N端的构象发生了很大变化。CB2 N端的10个氨基酸残基在配体分子结合口袋的上方形成一段较短的螺旋，不像CB1的N端是形成V型loop插入结合口袋并参与小分子配体的相互作用。CB2接近胞外的跨膜区相比于CB1更加收紧，CB2的TM1、TM2、ECL2和ECL3都向其结构中心收拢。与CB1类似，ECL2内部也形成一对二硫键（Cys174、Cys179）[29]稳定ECL2的构象。意外的是，拮抗剂结合的CB2反而与激动剂结合的CB1结构具有更高的相似性。

CB2的激动剂已经被证明可以有效地缓解炎症导致的疼痛、神经性疼痛和眼科疾病等[30-31]。然而，大部分的大麻素受体激动剂选择性差，会同时作用于两个受体，引起因作用于CB1而产生的精神副作用。2020年初Cell上报道了CB2与激动剂AM12033的晶体结构[28]（图2（b））。该结构与拮抗剂结合的CB2结构非常相似，激动剂AM12033和拮抗剂AM10257在CB2中的结合口袋也高度相似，仅仅是TM1、TM4和TM7的胞外部分向内微小运动形成了一个更紧凑的激动剂结合口袋。与激动剂结合的CB2和CB1在胞外跨膜区部分的结构也较为相似，而胞内部分CB1表现出了部分激活特征，CB2则仍处于非激活状态。正是因为CB1和CB2在结构上的细微差异，造成了两个大麻素受体在功能上的区别[28]。结构显示，CB1和CB2的激动剂结合口袋非常相似，包括结合方式和关键氨基酸，这也从结构上解释了大麻素受体激动剂选择性差的原因。

CB2和CB1一样主要通过与Gi/o蛋白偶联来抑制腺苷酸环化酶和cAMP信号传导而引起生理反应。与CB1-Gi复合物相比，CB2-AM12033-Gi复合物的结构显示出相似的相互作用方式，CB2和Gi之间的接触是通过Gαi亚基广泛介导的，主要相互作用界面由受体的TM3、TM5、TM6和ICL2以及Gαi亚基的α5螺旋、αN螺旋和αN-β1环组成[28]（图2（c））。与其他已解析的GPCR与Gi复合物的结构比较，CB2和CB1的TM5更加延伸，与Gαi亚基的α5螺旋形成更多的相互作用。通过CB1-AM841-Gi和CB2-AM12033-Gi复合物结构比较，发现ICL2可能是影响两个受体对不同G蛋白的选择性的因素之一。同期Cell报道了激动剂WIN55,212-2结合的CB2-Gi的复合物结构[32]（图2（d）），由于与大多数CB1和CB2激动剂不同，WIN 55,212-2在不引起CB2内化的情况下激活G蛋白信号传导途径，该性质被认为避免了药物耐受性的发展。这些结果提供了有意义的信息，从分子水平揭示了CB2与配体的相互作用以及信号转导机制，将有助于合理设计和开发具有高亲和力和选择性的靶向CB2的小分子药物。

6 结论与展望

由于在疼痛、肥胖、炎症、癌症和各种精神类疾病中的治疗潜力，内源性大麻素系统一直以来就是一个极具吸引力的研究领域。然而大麻素受体CB1的正构激动剂发展成安全有效的药物需要突破成瘾或抑郁等副作用的壁垒，而CB2的配体尤其是正构激动剂则需要增强其特异性以避免触发CB1或者其他潜在大麻素受体的活性。虽然近几年关于CB1和CB2的结构生物学研究取得了一系列突破性进展，加深了人们对配体作用方式和机制的理解，但是进一步研究探索既没有副作用又可以有效阻断大麻素引起的过度反应，继而提高大麻素类药物治疗指数的配体仍然至关重要。本文概述了有关大麻素以及内源性大麻素系统的一些特性，总结了大麻素受体的结构研究进展。这些发现让我们对内源性大麻素系统有了基本的理解，希望将来可以从原子、分子、细胞甚至动物水平进一步研究不同配体对大麻素受体的调控机制，为设计优化更加高效和安全的药物提供指导。