耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2基因型的研究

陈咏君 郎华 徐芳芫 刘姝 赵男

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种条件致病菌,同时也是医院感染的主要病原菌之一［1］。随着广谱抗菌药物的广泛使用以及抗菌药物使用量的不断增加,多重耐药铜绿假单胞菌(multi-drug resistance Pseudomonas aeruginosa,MDRP)及泛耐药铜绿假单胞菌不断产生［2］。亚胺培南属于碳青霉烯类药物中常用的一种,近年来,由于亚胺培南在临床上的大量使用,导致耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌引起的感染不断增多,这些问题已经成为威胁人们健康的重要公共卫生问题,同时耐药菌的增加也是临床治疗的重要挑战。尤其是由于我国抗生素的广泛应用,使得我国部分细菌的耐药显著高于西方国家［3］。因此,检测医院内的耐药情况,找寻其耐药的机制,是亟待解决的问题。本研究对其耐药机制进行了探讨,旨在为临床合理使用抗菌药物治疗铜绿假单胞菌的感染提供较有价值的依据。现对沈阳某教学医院2017～2019年铜绿假单胞菌感染情况进行回顾性分析,并将收集的耐亚胺培南铜绿假单胞菌进行耐药机制研究,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集沈阳医学院附属第二医院2017年1月～2019年12月所有临床送检样本中分离的253 株铜绿假单胞菌,其中亚胺培南耐药铜绿假单胞菌15 株。来自同一患者相同部位的菌株只分析第1 株。标本包括痰、脓、咽拭子等。铜绿假单胞菌(ATCC27853)由卫健委临床检验中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 细菌基因提取试剂盒(上海生工有限公司)；Tag 酶及 PCR 相关试剂(上海生工有限公司)；PCR 引物(上海生工有限公司合成)；全自动微生物鉴定分析仪(法国生物梅里埃)、PCR 仪(上海宏石)、电泳仪(美国伯乐)、恒温振荡培养箱(上海)；超速低温离心机(美国赛默飞)；紫外凝胶成像仪(美国 Alpha Innotech)。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 公布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献设计［4］,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列见表1。

表1 基因引物一览表

1.4 方法

1.4.1 DNA 提取 严格按照操作说明提取基因组DNA。

1.4.2 PCR 扩增体系 扩增反应总体积为25 μl,DNA模板3 μl,上下引物各0.5 μl,2×TaqPCRMasTerMix 12.5 μl 加无菌去离子水至 25 μl。

1.4.3 PCR 反应条件 基因热循环扩增条件：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃ 延伸1 min,共30 个循环,最后72℃延伸10 min。

1.4.4 琼脂糖凝胶电泳 1 g 琼脂糖粉末与100 ml 0.5×TBE 缓冲液混合加热煮沸,冷却至80℃后,制备成1%的琼脂糖凝胶。2 μl 上样缓冲液与5 μl PCR 扩增产物混合后加入1%琼脂糖凝胶孔,10×TBE 为电泳缓冲液,用水平式电泳槽140 V,电流为80 mA,时间为40 min。EB 染色20 min,300 nm 紫外灯观察结果,凝胶成像系统成像。

2 结果

15 株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌检出OprD2 基因5 株(见图1)、blaVIM 基因4 株(见图2)、blaOXA-10基因8 株(见图3)；均未检出blaGES、blaIMP、blaGIM、blzSIM、blaTEM、blaPER、blaVEB 基因。

图1 OprD2 基因PCR 电泳扩增图M:marker 1～15 为标本

图2 VIM 基因PCR 电泳扩增图M:marker 1～10 为标本

图3 OXA-10 基因PCR 电泳扩增图M:marker 1～10 为标本

3 讨论

铜绿假单胞菌分布广泛,广泛分布于自然界、土壤、水、空气、人体皮肤、肠道、呼吸道。同时铜绿假单胞菌也是临床上最常见的条件致病菌之一,其以呼吸系统感染为主,现已成为医院感染的主要病原菌之一［5,6］。最近一些年,碳青霉烯类广谱抗生素在临床的大量应用,导致临床分离的耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌出现上升现象。通过研究发现,铜绿假单胞菌的耐药机制包括以下几种［7,8］：①细菌产生灭活酶；②膜通透性下降；③抗菌药物作用靶位改变；④细菌生物被膜形成；⑤基因突变；⑥获得外源性耐药基因；⑦其他耐药机制。在以上的这些耐药机制中,金属β-内酰酶(MBL)是铜绿假单胞菌产生的最主要碳青霉烯酶,此耐药机制可以水解除氨曲南以外所有β-内酰胺酶类抗生素。同时外膜孔蛋白OprD2 是碳青霉烯类抗生素进入菌体内的特异性通道,而外膜孔蛋白OprD2 的缺失将导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药［9］。对于耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌国内外的研究如下：国际方面已经检出blaIMP、blaVIMb、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blsAIM 基因,而国内关于铜绿假单胞菌的研究是已检出blaIMP、blaVIM、blaSPM 基因,其中blaIMP、blaVIM 这两个基因检出较多［10-12］。

有研究表明,耐碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌的分离率每年都在增长,本次研究中痰液标本分离率为最高,这和陶春梅等［13］的报道结果相符。本此研究药敏试验结果显示,2017年1月～2019年12月,沈阳医学院附属第二医院共分离出253 株铜绿假单胞菌。这253 株铜绿假单胞菌感染主要以痰标本为主,共240 株,所占比例为94.9%；其次是尿液6 株,所占比例为2.4%；分泌物3 株,所占比例为1.2%；脓汁2 株,所占比例为0.8%。从病房的分布情况来看,检出菌株率分别是呼吸、干诊三病房、冠心病监护病房(CCU)、干病房、神经外科病房等。其中呼吸病房共检出68 株,占26.9%；干三病房共检出67 株,占26.5%；CCU 共检出29 株,占11.5%。其中庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率均较高,在2018年庆大霉素的耐药率达到63.5%,为耐药率最高；多粘菌素B 为3年来耐药率最低。回顾性分析过去3年本院的耐药情况,总体在2019年得到有效控制。这和医院这些年对于耐药问题的重视有关,积极控制抗生素的使用有很大的关系［14］。

本研究中15 株耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌携带耐药基因结果如下：其中外膜孔蛋白 OprD2 缺失5 株,携带率为33.3%；VIM 型阳性4 株,携带率为26.7%；OXA-10 型阳性8 株,携带率为53.3%；未扩增出其他基因型。外膜孔蛋白OprD2 是一类底物特异性蛋白,它可促进碳青霉烯类药物、氨基酸等进入细胞,外膜孔蛋白OprD2 基因缺失或降低可以使抗生素不能进入到指定的部位发挥其作用,从而增加铜绿假单胞菌对碳青霉烯酶类药物产生的耐药机制［15,16］。本次研究中检测出外膜孔蛋白OprD2 缺失5 株,说明外膜孔蛋白OprD2 缺失可能是沈阳医学院附属第二医院铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的重要原因之一。同时本次研究中外膜孔蛋白OprD2 基因缺失率与韦柳华［17］报道的16.13%的报道相接近,但是与华东地区的袁莉莉等［18］报道的缺失率85.6%和黑龙江地区的刘沫然等［19］报道的缺失率86.3%存在一定差异。这可能与菌株来源、标本收集例数、临床用药习惯、医院对于院感重视程度等一系列原因有关。目前认为MDRP 对碳青霉烯类药物耐药的机制非常复杂,在本次研究中发现携带OXA-10 耐药基因的细菌8 株,这说明了可能产抗生素水解酶耐药机制在本研究菌株介导的耐药过程中占主导地位,对于本院铜绿假单胞菌产抗生素水解酶耐药机制,会在后续研究中报道。虽然有研究指出产生金属酶和外膜孔蛋白OprD2 缺失是引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯酶耐药的主要原因［20,21］,但是这种现象与本研究还是存在一定的差异,本研究外膜孔蛋白OprD2 基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因之一。

本此研究结果显示,2017～2019年沈阳医学院附属第二医院收集的15 株耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌中,发现个别菌株未出现 OprD2 基因的缺失,也未出现金属酶耐药机制,在本次研究耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌中,可能有其他耐药机制的存在,例如主动外排系统的过度表达；或者是生物膜的形成,使抗菌药物不能有效到达作用部位等。对于这些菌株将在后续的研究中,为临床及医院的感染控制提供依据,同时也可对耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌耐药机制进行更深一步的研究。

综上所述,由于抗生素的大量使用,耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌引起的医院感染变得每日俱增,这已经成为临床科室必须要面对的一个非常严重的问题。因此,医院应加强对碳青霉烯酶耐药铜绿假单胞菌耐药机制的检测和监控,合理使用抗生素。