南酸枣皮果酒的化学成分和体外生物活性研究
2021-02-07蒋彤吕新林凌华山陈斌田潘婷朱晶晶王智民刘志高刘继延
蒋彤,吕新林,凌华山,陈斌,田潘婷,朱晶晶*,王智民*,刘志高,刘继延
(1.中国中医科学院中药研究所,中药质量控制技术国家工程实验室,北京 100700;2.天津中医药大学中药学院,天津 301617;3.江西齐云山食品有限公司,江西 赣州 341000)
南酸枣 [Choerospondias axillaris(Roxb.)Burtt et Hill],属无患子目漆树科南酸枣属植物。主要分布在我国的暖温带省区,日本、印度等国家也有分布。南酸枣具有悠久的药用和食用传统,属药食两用植物[1]。南酸枣以干燥成熟果实入药,是藏药和蒙药医治心病的常用药材之一[1]。2015年版《中国药典》记载南酸枣能行气活血,养心安神,常用于气滞血瘀,胸痹作痛,心悸气短,心神不安[2]。近年来中药产业蓬勃发展,推动了南酸枣在食品领域的广泛开发利用,南酸枣果肉被开发为南酸枣糕,对食欲不振、厌食和食滞腹痛有良好的辅助作用,日益受到消费者的青睐[3]。但在南酸枣糕产品加工过程中,产生了占加工总量30%的南酸枣皮副产物,造成巨大资源浪费的同时也带来了环境污染问题。研究表明,南酸枣皮富含丰富的营养成分和生物活性物质,如原花青素、黄酮、酚酸、多种维生素、有机酸、多糖、膳食纤维和矿物元素[1]。南酸枣皮原花青素具有抗氧化、抗结肠癌细胞增殖、降血糖等生物活性[1,4-5]。南酸枣总黄酮可以防治心脑血管疾病,保护大鼠心肌缺血,对实验大鼠心率失常有拮抗作用[1,6]。将南酸枣皮添加到压缩食品中,在增加压缩食品营养成分的同时,还能促进淀粉的消化[7]。
随着社会经济发展和人民生活水平提高,果酒已深受消费者青睐。以南酸枣皮为原料经发酵加工而成的纯天然南酸枣皮果酒,不但风味独特,酯香醇厚,还具有一定的保健功能。本研究在明确南酸枣皮果酒化学成分的基础上,进一步开展抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究,以期充分利用南酸枣皮副产物开发高值化附加产品,为南酸枣果皮综合利用和南酸枣皮果酒等相关产品开发提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜南酸枣由江西齐云山食品有限公司提供;酿酒酵母WLP775:美国White Labs公司;白砂糖:市售;蒸馏水:广州屈臣氏公司;乙腈(色谱纯):美国Fisher公司;甲酸(质谱级):美国Sigma-Aldrich公司;十二水合磷酸氢二钠、无水碳酸钠、盐酸、香草醛、氢氧化钠、亚硝酸钠、九水硝酸铝(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;十二水合磷酸二氢钠、甲醇(分析纯):北京化工厂;柠檬酸(批号171130-03):成都普思生物科技有限公司;原花青素B2(批号CHB170225)、儿茶素(批号CHB170313)、维生素 C(批号 CHB171011)、绿原酸(批号CHB160418):成都克洛玛生物科技有限公司,纯度均>98%;槲皮苷(纯度≥98%,批号 111538-200403)、没食子酸(C7H6O5含量为90.1%,批号110831-200803):中国食品药品检定研究院;DPPH:北京Coolaber科技有限公司;果胶酶(酶活500 U/mg):上海源叶生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(液体,酶活≥70万U/mL)、对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖、芦丁(批号Y06J8S37439,纯度≥98%):上海源叶生物科技有限公司;福林酚试剂:北京索莱宝科技有限公司;SO2气体:天津环达亚气体公司。
1.2 仪器与设备
ACQUITYUPLC超高效液相色谱仪、XevoG2-SQTof质谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱:美国 Waters公司;XSE 105DU 分析天平:梅特勒-托利多;THZ-98A恒温振荡器:上海一恒科学仪器有限公司;Multiscan FC酶标仪:赛默飞世尔科技公司;T6新世纪紫外分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 南酸枣皮果酒的酿造
1.3.1.1 酿造工艺流程
南酸枣皮果酒制备工艺流程:南酸枣清洗→南酸枣漂烫灭菌→沥干→剥皮→破碎→灭菌→果胶酶和50 mg/LSO2处理→接种加料→主发酵→过滤去渣→后发酵→过滤→陈酿→过滤→灭菌装罐[8-9]。
1.3.1.2 操作要点
南酸枣以成熟无腐烂变质的果实为佳,洗净后在95℃左右的热水中漂烫2 min~3 min,既利于皮肉分离和破碎加工,又可以抑制果实中的多酚氧化酶活性,抑制氧化;将南酸枣皮破碎,过滤得到果汁;果汁进行高温瞬时灭菌,120℃条件下加热15 s后迅速冷却,以免果汁的营养成分被高温破坏,添加0.5%果胶酶,40℃酶解2 h,提高出汁率,装罐前用SO2熏罐,并加入50 mg/L的SO2;酵母使用前要进行复水活化,将干酵母加入38℃含糖量5%的糖水,搅拌溶解,15 min~30 min后冷却至28℃~30℃与处理好的南酸枣皮汁混合均匀,酵母接种质量为原汁质量的0.03%~0.05%,发酵罐在25℃~28℃条件下密闭发酵4 d~5 d,用经巴氏灭菌的纱布过滤得汁液;将果酒液装入不锈钢罐中,用盖密封,放置在17℃~19℃下,后发酵1个月;后发酵的酒液用多层灭菌纱布再次过滤于不锈钢罐中,最后在低温12℃~15℃,湿度70%,没有强光照射的清洁环境下陈酿2个月;采用有机陶瓷膜设备过滤,灭菌、装罐。
1.3.2 液相色谱-质谱联用技术 (liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)检测
1.3.2.1 对照品溶液制备
分别精密称取没食子酸、原花青素B2、儿茶素、柠檬酸、绿原酸、槲皮苷对照品5 mg,分别置于25 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度。
1.3.2.2 供试品溶液的制备
取南酸枣皮果酒样品,12 000 r/min离心20 min,取上清液备用。
1.3.2.3 色谱条件和质谱条件
色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱,乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱,洗脱程序:0~8.34 min,2%~12%A;8.34 min~13.55 min,12% ~19%A;13.55 min~20.84 min,19% ~70%A;20.84 min~25.01 min,70%~100%A;25.01 min~26 min,100%A;柱温 35 ℃,体积流量 0.4 mL/min,进样量 2 μL,检测波长 200 nm~700 nm。
质谱条件:电喷雾离子源,正负离子模式扫描,离子源温度120℃,雾化气为N2,质量扫描范围m/z 100~2000,累积时间0.2s,锥孔电压40V,毛细管电压2kV,碎片离子碰撞能量20 eV~50 eV,母离子碰撞能量6 eV,脱溶剂气流速600 L/h,锥孔气体流量50 L/h,脱溶剂气温度400℃,数据的采集和处理软件为Mass Lynx 4.1质谱工作站。
1.3.3 南酸枣皮果酒中总黄酮、总原花青素和总酚的含量测定
1.3.3.1 南酸枣皮果酒中总黄酮的含量测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法[10]进行南酸枣皮果酒中总黄酮的含量测定。取100 μL南酸枣皮果酒置于25 mL容量瓶中,加70%乙醇至6 mL,加5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀,放置 6 min,加 NaOH 溶液 10 mL,再加70%乙醇至刻度,摇匀,放置15 min。以未加标准品溶液作为空白,在500 nm的波长处测定吸光度。以芦丁为标准品,得到标准曲线方程为y=11.023x-0.029 9,R2=0.999,总黄酮含量以每毫升南酸枣皮果酒所含芦丁质量表示。
1.3.3.2 南酸枣皮果酒中总原花青素的含量测定
采用香草醛-盐酸法[11]测定南酸枣皮果酒中总原花青素的含量。分别吸取50 μL南酸枣皮果酒至10 mL试管中,用甲醇稀释至1 mL,再向其中加入6 mL浓度为0.04 g/mL的香草醛甲醇溶液和3 mL浓盐酸,定容,混匀,在25℃下避光反应30 min后,用甲醇代替标准品作空白对照,于500 nm处测定吸光度。以儿茶素为标准品得到标准曲线方程为y=3.085 4x+0.052 1,R2=0.999,总原花青素含量以每毫升南酸枣皮果酒所含儿茶素质量表示。
1.3.3.3 南酸枣皮果酒中总酚的含量测定
采用福林酚法[12]测定南酸枣皮果酒中总酚含量。精密量取50 μL南酸枣皮果酒置于25 mL棕色量瓶中,加入福林酚试液1 mL,再加水11.95 mL,用29%碳酸钠溶液稀释至刻度,摇匀,放置30 min,以相应的试剂为空白,在760 nm的波长处测定吸光度,以没食子酸为对照品得到回归方程为y=107.55x+0.063 7,R2=0.999 9。总酚质量浓度以每毫升南酸枣皮果酒所含没食子酸质量表示。
1.4 南酸枣皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性
α-葡萄糖苷酶可使淀粉水解为葡萄糖,其抑制剂与小肠中的α-葡萄糖苷酶竞争性结合,使淀粉水解的速度减缓,降低血糖[13]。α-葡萄糖苷酶可使对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)产生对硝基苯酚,于碱性溶液中呈鲜黄色。将南酸枣皮果酒冻干得到南酸枣皮果酒粉末,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)配成不同浓度的溶液。用紫外分光光度计测定生成的对硝基苯酚的含量可以计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率[14]。于96孔板中加入50 μL不同浓度的样品溶液或/和50 μL 280 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,在37℃恒温振荡器中孵育10 min后,加入50 μL 4 mmol/L的pNPG溶液开始反应,于405 nm波长下测定吸光度值记为A样品;用pH 6.8的磷酸盐缓冲液代替样品溶液,于405 nm波长下测定吸光度值记为A阴性对照,阴性对照显示鲜黄色,提示反应终点。加入50 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。本试验以阿卡波糖为阳性药,平行3个复孔,按公式(1)计算抑制率。
1.5 南酸枣皮果酒DPPH自由基清除能力
参考文献[15-17]中DPPH法并进行适当调整。将南酸枣皮果酒冻干得到南酸枣皮果酒粉末,用乙醇配制成不同浓度的样品溶液。用无水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液。在比色管中加入2 mL DPPH溶液和1 mL样品溶液,避光反应30 min,在515 nm波长下测定吸光度,记为Ai;2 mL DPPH和1 mL无水乙醇的吸光度值记为Ac;2 mL无水乙醇和1 mL样品溶液的吸光度值记为Aj;3 mL无水乙醇作为空白对照;维生素C作为阳性对照,试验重复3次。按公式(2)计算DPPH自由基清除率。
1.6 数据处理
质谱分析采用Mass Lynx 4.1软件进行数据采集及分析;抗氧化和降血糖活性的测定采用SPSS 21.0数据处理软件计算IC50值。
2 结果与分析
2.1 南酸枣皮果酒的化学成分研究
2.1.1 南酸枣皮果酒的色谱峰指认
通过与对照品的LC-MS/MS数据比对,并结合文献质谱数据,总结质谱指认结果,从南酸枣皮果酒中共指认了34个化合物,其中黄酮类化合物18个,有机酸类化合物11个,酯类化合物5个,此外还有3个未知化合物,结果见图1和表1。
2.1.2 南酸枣皮果酒中总黄酮、总原花青素和总酚的含量测定结果
根据质谱定性分析结果,南酸枣皮果酒含有丰富的生物活性成分,进一步采用紫外分光光度法对南酸枣皮果酒中的总黄酮、总原花青素和总酚进行定量分析的结果见表2。
如表2所示,南酸枣皮果酒富含丰富的营养成分和生物活性物质,如原花青素、黄酮和多酚。其中总黄酮含量最高,可达到15.239mg/mL;总酚含量为7.595mg/mL;总原花青素含量为4.015 mg/mL。有研究表明,南酸枣皮中的生物活性成分具有良好的抗氧化、抗结肠癌细胞增殖、降血糖活性[28]。这为南酸枣皮果酒良好的保健功能和开发前景提供了数据支撑。
2.2 南酸枣皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性结果
南酸枣皮果酒可通过抑制α-葡萄糖苷酶活性,使淀粉水解速度减缓,达到降血糖的功效,结果见图2。
图1 负离子模式下的南酸枣皮果酒总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram in negative ion mode of Choerospondias axillaris fruit peel wine
表1 南酸枣皮果酒色谱峰质谱指认Table 1 Identification of chemical components of Choerospondias axillaris fruit peel wine
表2 南酸枣皮果酒中总黄酮、总原花青素和总酚的含量测定结果Table 2 Determination results of total flavonoids,total proanthocyanidins and total phenols in Choerospondias axillaris fruit peel wine mg/mL
图2 南酸枣皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性结果Fig.2 The inhibition activity on α-glucosidase of Choerospondias axillaris fruit peel wine
如图2所示,α-葡萄糖苷酶抑制率随样品和阿卡波糖浓度增加而升高,当南酸枣皮果酒的浓度达到50 mg/mL时,对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率可达到75%。用SPSS 21.0软件计算IC50值,南酸枣皮果酒抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值为10.996 mg/mL,阿卡波糖为0.0915 mg/mL。南酸枣皮果酒的α-葡萄糖苷酶抑制活性与其含有丰富的总黄酮、总原花青素和总酚等化学成分有关。
2.3 南酸枣皮果酒的体外抗氧化活性
南酸枣皮果酒体外抗氧化活性结果见图3。
图3 南酸枣皮果酒体外抗氧化活性结果Fig.3 The antioxidant activity in vitro of Choerospondias axillaris fruit peel wine
由图3可知,南酸枣皮果酒具有较强的DPPH自由基清除能力。DPPH自由基清除率随样品和维生素C浓度增加而升高,当南酸枣皮果酒的浓度达到40 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率可达到99.95%。用SPSS 21.0软件计算IC50值,南酸枣皮果酒清除DPPH自由基的IC50值为2.656 mg/mL,维生素C为16.35 μg/mL。由于南酸枣皮果酒中富含种类更为丰富的黄酮和多酚等抗氧化活性成分,所以南酸枣皮果酒具有一定的DPPH自由基清除能力和体外抗氧化活性。
3 讨论与结论
南酸枣在食品领域开发利用的过程中,产生了大量枣皮副产物未得到充分利用,不但造成了资源的浪费,还带来了环境污染问题。在开展南酸枣皮副产物化学成分和生物活性研究的基础上,进行了南酸枣皮果酒等高值化产品研发。南酸枣皮果酒酒精度低,口感好,适用人群广泛,操作简单,生产方便有利于南酸枣皮的综合利用,提升其附加价值,拓展南酸枣产业链,为类似废弃物的综合利用提供思路[30]。
现有文献研究表明南酸枣果皮含有丰富的原花青素、有机酸、黄酮和酚类化合物[1,18-20]。本试验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS联用和紫外分析检测技术,对南酸枣皮果酒进行化学成分定性定量分析,并评价南酸枣皮果酒的抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性。通过对照品比对和参考文献数据,从南酸枣皮果酒中发现34个化合物,南酸枣皮果酒的化学组成比南酸枣果皮更为丰富,南酸枣皮果酒在发酵过程中产生了种类更为丰富的酯类、有机酸类和黄酮类化合物。南酸枣皮果酒中新产生的酯类成分如阿魏酸酒石酸酯、原儿茶酸己糖酯,可以使南酸枣皮果酒呈现发酵的浓郁果香。果酒发酵过程中新产生的有机酸类成分如丁香酸、花生酸、花生油酸和对香豆酰奎尼酸,不但可以使南酸枣皮果酒呈现独特的风味,还能起到改善食欲,促进消化吸收,调节人体酸碱平衡的作用。南酸枣皮果酒中新产生的黄酮类化合物有槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、牡荆素和EPSILON-白藜芦醇脱氢二聚体。体外活性试验表明,南酸枣皮果酒展现出一定的抗氧化能力和体外降血糖活性。此研究结果为南酸枣皮果酒等高值化产品开发和南酸枣果皮废弃物的综合利用提供数据支撑。