量子点标记荧光免疫试纸条可视化检测肉品中志贺氏菌研究

朱芳茜，何扩*，张秀媛，魏东，王硕，李育峰，陈一，赵瑞平

（1.河北省农产品食品质量安全与检测重点实验室，河北北方学院，河北 张家口 075000；2.南开大学，天津 300000）

志贺氏菌（Shigella sp.）是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位，它主要侵染人体的结肠，引发肠道炎症、溃疡以及频繁的黏液性血性腹浑，少数严重可导致惊厥、低钠血症、低血糖、溶血性尿毒综合征、肠穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6亿人传染此类疾病，约有110万人死亡，其中5岁以下儿童为主要受害者[3]。在我国，由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢疾、腹泻等疾病时有发生[4]。因此，建立一种快速、准确的志贺氏菌检测方法显得尤为重要。

目前，志贺氏菌常规检测方法主要有两大类：一是传统培养计数法，二是快速检测法。传统生化培养法具有结果准确，且无需复杂设备等特点，但由于步骤繁琐、周期长、试剂繁多等缺陷，远远不能满足现代快速检测的需要[5-6]。基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术、分子生物学原理的各种快速检测法具有检测准确的优点，但由于其需要昂贵的试剂和设备、有时需带回专业实验室检测等缺陷，无法满足现场分析的需要[7-9]。荧光量子点（quantum dot，QD）本身具备光稳定性好、荧光强度高、激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、发射波长可调等优越的发光特点，且通过对量子点表面修饰不同的官能团（如-COOH、-NH2），即可使其很容易与生物大分子如抗体等进行偶联[10-11]，因此，以量子点作为标记物可显著提高免疫层析试纸条的灵敏度和稳定性。此外，运用发射波长差异的多种荧光量子点分别偶联多种检测抗体，可实现多种抗原的集成定量检测[12-13]。

本研究采用CdTe量子点偶联志贺氏菌抗体作为荧光标记，制备一种用于能快速可视化检测志贺氏菌的免疫荧光试纸条，原理见图1，该试纸条可实现对肉品中志贺氏菌的快速、简便、可视化定量检测。

图1 量子点荧光免疫层析试纸条示意图Fig.1 Schematic diagram of quantum dots fluorescent immunochromatographic strip

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰醋酸镉[Cd（CH3COO）2·2H2O]、亚碲酸钾（K2TeO3）、硼氢化钠（分析纯，96%）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；谷胱甘肽、羊抗鼠二抗：美国Sigma公司；志贺氏菌鼠单克隆抗体：河北省农产品食品质量安全检测重点实验室（河北北方学院）自制；志贺氏菌（ATCC12022）、沙门氏菌（ATCC 50071）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）菌株：河北省农产品食品质量安全检测重点实验室保存制备；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸：上海金标生物科技有限公司；志贺氏菌胶体金试纸条：广州市益满生物科技有限公司；猪肉、火腿肠：市售；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

JEM-2100高分辨率透射电子显微镜：日本电子株式会社；F-2500 FL荧光光谱仪：日本Hitachi公司；pHS-3C酸度计：上海雷磁公司；HM3230点膜仪、ZQ2002自动切条仪：上海金标生物科技有限公司；WI95549冷冻干燥仪：东西仪（北京）科技有限公司；GZX-9240MBE电热恒温干燥箱：上海博迅实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 CdTe量子点的制备

称取15.6 mg的冰醋酸镉溶解于50 mL双蒸水中，然后加入20 μL谷胱甘肽，缓慢滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液，至pH10.5。称取5 mg的亚碲酸钾溶解于50 mL双蒸水中，将pH10.5冰醋酸镉溶液和亚碲酸钾溶液混合到一起，称取40 mg的硼氢化钠加入混合液中，搅拌至硼氢化钠完全溶解为止后将溶液转入到250 mL的三口圆底烧瓶，油浴加热，100℃回流3 h，取样2 mL于离心管中，分别用透射电子显微镜以及荧光光谱仪对其进行表征[14-15]。

1.3.2 量子点标记志贺氏菌抗体

取150 μL的谷胱甘肽稳定的CdTe量子点溶液加入到1 mL pH7.4 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，加入 50 μL 对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]和 50 μL N-N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），振荡条件下活化20min，加入20 μL志贺氏菌单克隆抗体，37℃、180 r/min振荡4 h，加入浓度为1%的牛血清白蛋白。混匀 30 min，15 000 r/min 离心 20 min，取沉淀，备用[16]。

1.3.3 荧光免疫层析试纸条组装

在硝酸纤维膜上用HM3230点膜仪喷涂志贺氏菌鼠抗和羊抗鼠二抗形成检测带和质控带，将量子点标记好的志贺氏菌抗体均匀地喷涂在样品垫上，将样品垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次组装，用试纸条切刀切割成试纸条，干燥箱干燥后封装，避光保存于4℃备用[17-18]。

1.3.4 试纸条检测方法建立及其结果判定

将志贺氏菌菌悬液10倍梯度稀释制备的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志贺氏菌菌液分别滴加到试纸条加样孔中，反应5 min，待免疫反应达到平衡后，在紫外灯下观察质控线和检测线，每个样本重复测定6次。结果判定：目视T带的荧光强度，与空白对照，荧光越弱，代表待测溶液中含被测物的浓度越低，出现荧光的最低浓度即为最低检测限。

1.3.5 试纸条在食品样品中检测适用性评价

选取火腿肠、猪肉（肉制品实际样品）作为检验对象，称取1 g火腿肠和猪肉分别加5 mL超纯水捣碎，滤去火腿和猪肉肠渣，分别取0.9 mL火腿肠和猪肉过滤液，加入100 μL志贺氏菌菌液。样品分别10倍梯度稀释成菌浓度约 1×105、1×104、1×103CFU/mL 待测，待测液分别用制备量子点荧光免疫层析试纸条和市售志贺氏菌胶体金试纸条进行检测。

2 结果与分析

2.1 CdTe量子点的结构表征

量子点的结构表征结果见图2。

图2 CdTe量子点表征Fig.2 Symptom of CdTe quantum dots

从图2（A）中可以看出，量子点微球的发射峰对称且窄，同时量子点的荧光强度可达到9000左右，从图2（B）可以看出制备的CdTe量子点大小均匀，粒径大小约为50 nm。说明合成的量子点较好。

2.2 量子点与志贺氏菌抗体的偶联

通过EDC/NHS活化体系活化后，偶连量子点与志贺氏菌抗体，分别取2 mL用PBS稀释的量子点、量子点与抗体偶联物、抗体原液，200 nm～800 nm全波长下紫外扫描鉴定，扫描结果见图3。

图3 量子点-抗体复合物紫外全波长扫描图Fig.3 Full-wavelength scanning of quantum dot-antibody complex

量子点与抗体偶联后，量子点的吸光度强度变大，志贺氏菌抗体的吸收峰基本接近于量子点的最大激发波长，导致量子点与抗体偶联物的最大激发波长发生蓝移。

2.3 量子点荧光免疫层析试纸灵敏度

将志贺氏菌菌悬液10倍梯度稀释制备的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志贺氏菌菌液分别滴加到试纸条加样孔中进行检测，检测结果见图4。

图4 荧光免疫试纸条灵敏度Fig.4 Sensitivity of fluorescent immunostrip

随着志贺氏菌浓度的降低，荧光强度越来越弱，当志贺氏菌浓度小于1×103CFU/mL，荧光消失，所以荧光免疫试纸条的检测限为1×103CFU/mL。

2.4 量子点免疫层析试纸特异性评价

将沙门氏菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽杆菌稀释成浓度为1×107CFU/mL，用制备的荧光免疫层析试纸条进行检测，每种菌样同一浓度重复检测6次，通过有无荧光判断试纸条的交叉反应性，结果见图5。

图5 荧光免疫试纸条特异性Fig.5 Specificity of fluorescent immunostrip

试验显示制备的荧光免疫层析试纸条与其它致病菌均无交叉反应，表明制备的试纸条特异性较好。

2.5 试纸条在食品样品中检测适用性评价

利用CdTe量子点制备的荧光免疫试纸条和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒对添加的志贺氏菌肉类实际样品进行检测，每个浓度菌样检测6次。检测结果见表1。

表1 量子点荧光免疫试纸条适用性测试Table 1 Applicability test of quantum dots fluorescent immunostrip

当菌样添加质量浓度为1×103CFU/mL时，试纸条检测均为阴性；志贺氏菌添加浓度为1×104CFU/mL时，荧光免疫试纸条检测结果为阳性，而胶体金试纸条为阴性。添加浓度为1×105CFU/mL时，荧光免疫试纸条和胶体金试纸条检测结果均为阳性，表明制备的荧光免疫试纸条对肉类实际样品的检测限为1×104CFU/mL，与胶体金试纸条相比，其灵敏度仍要高一个数量级。

3 结论

本试验利用谷胱甘肽为稳定剂成功合成了水溶性CdTe量子点，在EDC和NHS共价偶联的作用下，通过酰胺键连接了志贺氏菌单克隆抗体，在优化的试验条件下，成功制备了一种能特异性检测志贺氏菌的荧光免疫试纸条，其对肉制品实际样品的检测限可达1×104CFU/mL（目前市场上广泛引用的胶体金试纸条的检出限为1×104CFU/mL），为志贺氏菌市场快速检测提供了一个新的方法。