不同处理方式艾燃烧生成物对动脉粥样硬化小鼠炎症及斑块稳定性的影响*

黄跃平 姚 琴 欧阳夏荔 刘津艺 惠 鑫 王 昊 和 蕊 张 瑞 赵百孝

（北京中医药大学，北京 102488）

动脉粥样硬化（AS）是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础［1］。中医认为AS是因脏腑功能失调，酿生痰浊血瘀结于脉络导致痹阻不通。艾灸温通经脉、行气活血的功效与AS的病机高度契合。其起效因素包括热效应、艾烟等，可调控AS炎性反应以延缓AS病理进程［2］。本实验采用不同处理方式艾燃烧生成物（Moxa combustion products，MCP）干预动脉粥样硬化小鼠，进一步挖掘抗AS的相关作用成分。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用8周龄雄性ApoE-/-小鼠为AS模型，同龄相同遗传背景雄性非转基因C57BL/6小鼠为空白对照，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。空白组采用常规饲料喂养，其余采用高脂饲料喂养（北京维通利华实验动物有限公司，含15%猪油、2%胆固醇、0.05%胆酸），所有小鼠自由进食饮水，饲养环境温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%，人工控制室内照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和12 h黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循环。

1.2 试药与仪器 3年陈艾绒（规格：20 mm×200 mm）及三年陈艾叶精油（规格：500 mL/瓶），购自李时珍医药集团有限公司。自制小鼠圆筒网状固定器（规格：长90 mm，直径50 mm）；动式染毒柜（型号：HOPE-MED 8050，天津开发区合普工贸有限公司）；燃烧炉（自制）；P5L2C光散射式微电脑数字粉尘测试仪（北京宾达绿创科技有限公司）；Whatman剑桥滤片F319-04（直径92 mm），赛谱锐思（北京）科技有限公司生产；鱼跃超声雾化器（型号：402AI，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；干扰素-γ（INF-γ）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒；白细胞介素-10（IL-10）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒；基质金属蛋白酶9（MMP-9）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒；基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，北京瑞格博科技发展有限公司生产。

1.3 分组方法 40只雄性ApoE-/-小鼠采用随机数字表法分为5组（每组8只）：艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发物组、艾叶精油组、模型组。8只相同遗传背景同龄的雄性C57BL/6非转基因小鼠作为空白对照。各组小鼠适应性喂养1周后进行干预。

1.4 干预方法 1）空白组及模型组：均每日抓取、固定，将小鼠置于无艾烟染毒柜中，每日20 min，每周6 d。2）艾烟组：燃烧炉（与染毒柜相连）中点燃三年陈艾绒1.5 g，艾烟经管道导入染毒舱，流量根据预设遮光率全自动调控；艾烟浓度达到10 mg/m3～15 mg/m3之间时，染毒柜遮光率为2%左右［3］，20 min约燃烧3年陈艾绒1.5 g。3）滤过艾烟组：染毒舱艾烟入口处安装Whatman剑桥滤片以截留颗粒物［4］，艾烟生成同上。4）艾绒挥发物组：将艾绒平铺于玻璃管内，调设150℃对环形加热器预热，待各项参数稳定后，启动环形加热器对玻璃管进行恒温匀速移动加热，所用陈艾绒质量与艾烟组相等。5）艾叶精油组：取3.75 μL艾叶精油（1.5 g艾绒所含挥发油含量折合），雾化器中加入16 mL蒸馏水，并连接于染毒舱玻璃入口，雾化速度为0.8 mL/min［5］。干预组每日抓取、固定，将小鼠置于不同处理方式艾燃烧生成物浓度的染毒柜中，每日20 min，每周6 d。各组每天干预结束后，清洗染毒柜。所有组别均干预观察14周。

1.5 标本采集与检测 末次干预后，禁食不禁水12 h。小鼠麻醉后，眼眶静脉丛采集血液标本约1.5～2 mL，置于肝素钠抗凝采血管中，轻轻颠倒混匀，离心15 min（4℃ 3 500 r/min），之后置于-20℃冰箱中备用。采用INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1 ELISA试剂盒检测相应指标。每组随机选取6只小鼠，取出主动脉放入4%多聚甲醛固定，用于HE染色观察病理变化。

1.6 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件。计量资料以（）表示，若符合正态分布且方差齐，使用单因素方差分析，再使用LSD进行组间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠胸主动脉病理形态 见图1。正常组小鼠主动脉管腔大小正常，内皮细胞完整，未见AS斑块形成。模型组小鼠主动脉管腔明显狭窄，内皮细胞破裂，内膜及中膜明显增厚，弹力纤维断裂，有明显斑块形成，斑块内可见较多脂肪滴。艾烟组小鼠主动脉管腔大小正常，少量内皮细胞被破坏，弹力纤维少量断裂，较模型组显著改善。滤过艾烟组小鼠主动脉管腔轻度狭窄，少量内皮细胞被破坏，少量纤维斑块形成，较模型组显著改善。艾绒挥发组小鼠主动脉管腔轻度狭窄，弹力纤维少量断裂，少量脂质浸润，较模型组有改善。艾叶精油组小鼠主动脉管腔明显狭窄，内皮细胞明显破坏，中膜增厚，弹力纤维断裂，粥样硬化斑块形成且可见较多脂肪浸润，与模型组无显著差异。

图1 各组小鼠胸主动脉病理（HE染色，20倍）

2.2 各组小鼠血清INF-γ含量比较 见表1。与空白组相比，模型组血清INF-γ含量显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组血清INF-γ含量均显著降低（P＜0.05）；艾叶精油组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。各干预组组间比较无显著差异（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠血清IL-10含量比较 见表1。与空白组相比，模型组血清IL-10含量显著下降（P＜0.01）。与模型组相比，艾烟组、滤过艾烟组血清IL-10含量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；其余两组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。不同干预方式组组间比较：艾烟组血清IL-10含量显著高于艾绒挥发组和艾叶精油组（P＜0.05），其余组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比较（±s）

表1 各组小鼠血清中INF-γ、IL-10及INF-γ/IL-10比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与艾烟组比较，#P＜0.05。下同。

组别空白组模型组艾烟组滤过艾烟组艾绒挥发组艾叶精油组n 8 8 8 8 8 8 INF-γ（ng/L）65.88±13.56**100.33±23.07 70.38±22.97*72.31±17.70*74.33±25.85*90.42±31.64 IL-10（ng/L）98.81±14.87**51.26±14.31 95.33±30.36**77.34±14.14*62.48±22.34#69.45±24.68#INF-γ/IL-10（Th1/Th2）0.67±0.10**1.98±0.17 0.73±0.16**0.93±0.11**1.19±0.09#1.37±0.33#

2.4. 各组小鼠INF-γ/IL-10比较 见表1。与空白组相比，模型组INF-γ/IL-10比值显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，艾烟组、滤过艾烟组INF-γ/IL-10比值均显著降低（P＜0.01）；其余两组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。不同干预方式组组间比较：艾烟组INF-γ/IL-10比值显著低于艾绒挥发组和艾叶精油组（P＜0.05），其余组间比较无显著差异（P＞0.05）。

2.5 各组小鼠血清MMP-9、TIMP-1含量比较 见表2。与空白组相比，模型组小鼠血清MMP-9含量显著升高（P＞0.05），TIMP-1含量无显著差异（P＞0.05）。与模型组相比，艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组MMP-9含量显著降低（P＜0.05），艾叶精油组无显著差异（P＜0.05），艾烟组TIMP-1含量显著升高（P＜0.05），其余3组无显著差异（P＞0.05）。不同干预方式组组间比较：艾烟组、滤过艾烟组、艾绒挥发组MMP-9均显著低于艾叶精油组（P＜0.05），其余组间无显著差异（P＞0.05）；而艾烟组TIMP-1显著高于艾绒挥发组、艾叶精油组（P＜0.01），滤过艾烟组TIMP-1显著高于艾叶精油组（P＜0.01），其余组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比较（ng/mL，±s）

表2 各组小鼠血清中MMP-9、TIMP-1含量比较（ng/mL，±s）

注：与艾叶精油组比较，△P＜0.05。

组别空白组模型组艾烟组滤过艾烟组艾绒挥发组艾叶精油组n 8 8 8 8 8 8 MMP-9 22.06±2.36**38.07±9.66 22.20±6.73**△23.21±5.93*△22.40±5.57*△33.81±4.65 TIMP-1 124.28±15.42 130.63±15.10 174.62±15.87*155.60±21.46△137.91±17.04#130.78±20.59#

3 讨 论

滤过艾烟组采用剑桥滤片进行滤过艾烟，其颗粒物的截留率高达97.8%以上［4］，旨在观察滤过艾烟的成分是否为抗AS的起效因素。艾绒挥发组采用环形加热器加热艾绒而不使其燃烧，旨在观察艾烟（有燃烧过程）和艾绒挥发（无燃烧过程）抗AS疗效比较，以探索艾灸燃烧过程对于艾灸的必要性及重要性。艾叶精油组设置意义在于比较艾燃烧时所产生的挥发油及其他成分（艾烟）与仅用挥发油（艾叶精油）在抗AS的疗效，探索艾燃烧生成物相关有效成分抗AS的量效关系。本实验创新性设计出4种不同处理方式艾燃烧生成物干预AS的方法，以期阐明艾烟起效的相关性成分。

动脉粥样硬化斑块处存在大量的CD4+T细胞［6］。其中Th1细胞主要分泌促炎因子INF-γ具有致AS的作用，Th2细胞主要分泌抑炎性因子IL-10具有抗AS的作用［7］。炎性细胞在促炎因子作用下，分泌基质金属蛋白酶（MMP）降解纤维帽中胶原纤维，增加斑块不稳定性［8］。本研究选取炎症免疫反应中促炎因子INF-γ、抑炎因子IL-10以及影响斑块稳定性的MMP-9、TIMP-1，以阐明不同处理方式艾燃烧生成物对AS炎症反应及斑块稳定性的作用机制。

INF-γ能激发炎症反应，并促进MMP产生，最终造成斑块脱落［9］。此外，IFN-γ通过抑制血管损伤处平滑肌细胞增殖、收缩及胶原分泌，引起纤维帽变薄造成斑块不稳定［10］。IL-10可减轻血管内膜局部的炎症反应，降低炎性因子对平滑肌细胞的刺激作用［11］。此外，IL-10通过抗凋亡机制抑制泡沫细胞凋亡，并减少斑块中MMP的活性以增加斑块稳定性［12］。MMP-9是降解Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶最主要成员之一［13］，加速了动脉粥样硬化的进程及斑块的破裂［14］。而血清TIMP-1是MMP-9的内源性抑制物，对由MMP-9产生的基质降解起重要的平衡作用［15］。TIMP-1能减少斑块破裂的风险，起到稳定斑块的作用［16］。

本实验研究发现，ApoE-/-小鼠经高脂饲料喂养14周后其血清INF-γ、MMP-9含量升高，IL-10含量降低，说明ApoE-/-小鼠血管内存在炎症反应，并提示粥样斑块内不稳定性增加。经艾烟及滤过艾烟干预14周后，ApoE-/-小鼠血清中INF-γ、MMP-9含量显著降低，IL-10、TIMP-1含量显著升高，说明艾烟或滤过艾烟可通过调控炎症反应，促进MMP-9与TIMP-1之间的动态平衡以增强斑块稳定性，从而减缓AS的发展，提示艾烟及滤过艾烟在一定程度上效用相近，说明艾烟中的颗粒物成分可能不是艾灸起效的关键因素，这对于临床上使用隔烟罩滤过艾烟施灸，即能保证临床疗效，又可减少患者对艾烟颗粒物安全性的疑虑具有指导性价值。而与模型组相比，艾绒挥发组血清中IL-10、TIMP-1含量无显著性差异，艾叶精油清中INF-γ、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量均无显著性差异，一方面提示艾绒燃烧时氧化或热解生成的新物质可能是艾灸起效的关键成分，另一方面提示艾灸抗AS起效的关键在于艾绒加热挥发、热解、燃烧过程产生的物质。艾烟与滤过艾烟在改善AS炎症及增强斑块稳定性有一定疗效，可能与相应的炎性通路有关，进一步研究将在后续展开。