宁夏永宁葡萄育苗圃根结线虫鉴定*

赵 楠，顾沛雯，李嘉泓，张 乐

（1 宁夏大学葡萄酒学院，银川750021）（2 宁夏大学农学院）

根结线虫（Meloidogynespp.）是一类寄主范围广、危害严重的植物病原线虫，自身可携带并传播真菌、细菌和病毒等病原物，加重土传病害的发生，对农业生产造成较大影响[1]。1889 年Neal 首次在美国加州的葡萄上发现根结线虫，随后葡萄根结线虫危害日趋加重，在世界各地的葡萄园中均有发生，逐渐引起了许多学者的关注和重视。在我国，李长存等发现，根结线虫侵害葡萄植株后，会造成葡萄园减产25%～30%，严重时在80%以上[2]。研究发现，根结线虫在葡萄根内寄生为害，会刺激根系形成大量根结，严重干扰根系的正常生理过程，造成根部畸形、植株生长缓慢、枯萎等症状[3]。根结线虫已成为葡萄苗木生产上的一大障碍，因此准确鉴定葡萄根结线虫的种类至关重要。

宁夏永宁县是贺兰山东麓葡萄酒产区中最大的酿酒葡萄种植基地。近年来，随着当地葡萄栽培面积的扩大，根结线虫病扩散蔓延迅速、发生逐年增加，尤其在育苗圃中最为严重，导致葡萄苗木的质量下降，严重制约了宁夏葡萄产业的健康发展。本研究在调查宁夏永宁县葡萄育苗圃根结线虫病害的基础上，通过根结线虫雌虫和2 龄幼虫的形态特征及雌虫会阴花纹对葡萄根结线虫进行形态学鉴定，利用根结线虫线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）通用引物（C2F3/1108）及序列特异性扩增区（sequence characterized amplified region,SCAR）特异性引物（MI-F/MI-R 和Far F/Far R）对不同葡萄品种中的根结线虫进行分子生物学鉴定，以期为后期筛选和利用抗根结线虫的葡萄品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试葡萄苗木和虫源

供试葡萄苗木：2019 年5—10 月从宁夏永宁县农垦集团葡萄育苗基地生产区采集15 个葡萄品种的2 年生苗木，品种分别是‘赤霞珠’‘马瑟兰’‘黑比诺’‘西拉’‘阳光玫瑰’‘红芭拉蒂’‘大青’‘贝达’‘霞多丽’‘美乐’‘品丽珠’‘无核翠宝’‘夏黑’‘爱神玫瑰’和‘抗砧3 号’。

供试虫源：采用直接解剖法从15 个葡萄品种苗木的根结组织中获取雌虫（‘抗砧3 号’未检测出根结线虫）。每个葡萄品种挑取20 头雌虫，随机选取10 头雌虫用于形态学鉴定，14 个葡萄品种共选取140 头雌虫；剩余的10 头雌虫用于分子生物学鉴定。取葡萄苗木的根际土壤，用贝尔曼漏斗法从土壤中获取2 龄幼虫，用于形态学鉴定。

1.1.2 主要试剂和仪器

所用试剂：10×PCR Buffer（Mg2+free）和蛋白酶K，上海远慕生物科技有限公司；10×EasyTaq®Buffer、dNTPs、EasyTaq®DNA Polymerase 和DNA Maker，北京全式金生物技术有限公司；所用引物为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

所用仪器：DYY-C6 电泳仪，北京市六一仪器厂；SMZ171 体视显微镜，麦克奥迪实业集团中国有限公司；BX53 Olympus 正置荧光显微镜，日本奥林巴斯有限公司；Bio-Rad 梯度PCR 仪，Bio-Rad公司；Azure c200 凝胶成像仪，Azure Biosystems 公司。

赫利森之前也没有寻找这些通道。“作为一名临床医生，我不知道它们的存在，”她说，“我们认为骨头和大脑是两个不同的部分，脑膜在它们之间。我不知道它们之间可能存在某种联系。”但她认为会存在可能。“颅骨和骨髓腔紧贴大脑，”她说，“然而，从来没有人研究过这两个部分之间潜在的相互作用。”

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄根结线虫病的调查

按照随机取样的原则采集15 个葡萄品种的苗木，每个品种采集10 株苗木，共采集150 株苗木。采集时挖取整株苗木，将苗木装入自封袋内，标记葡萄品种、采样时间等信息，带回实验室后用清水冲洗干净置于4 ℃冰箱中备用。观察苗木根部症状，根据根结的有无判断苗木是否发病。选择具有代表性的病害品种，观察苗木的感病症状并拍照。

1.2.2 形态学鉴定

雌虫和2 龄幼虫的形态特征观察：参考刘维志的方法[4]，将获得的雌虫和2 龄幼虫制成临时玻片，于BX53 显微镜下观察根结线虫的整体虫态、口针特征和中食道球特征等形态特征。

雌虫会阴花纹的制作与观察：参考刘维志的方法[4]制作根结线虫会阴花纹，将分离得到的雌虫放在干净的滴有45%乳酸的载玻片上，用解剖刀切下包含完整会阴花纹的角质膜，制成临时玻片，于BX53 显微镜下观察。

1.2.3 分子生物学鉴定

单头根结线虫的DNA 提取：采用蛋白酶K 法[5]分别提取140 头根结线虫的DNA。取单头雌虫放入PCR 管中，加入8.0 µL ddH2O 和1.0 µL 10×PCR Buffer（Mg2+free），液氮中放置1 min，85 ℃水浴2 min；加入1 mg/mL 的蛋白酶K 1 µL，55 ℃水浴15 min，95 ℃水浴10 min，得到DNA 模板。DNA模板放在-80 ℃冰箱内保存备用。

根结线虫mtDNA-PCR 扩增：利用根结线虫mtDNA 的COⅡ和LrRNA基因间序列通用引物C2F3/1108 对不同葡萄品种中的根结线虫进行PCR扩增[6]。25 µL PCR 反应体系：引物各0.5 µL，10×EasyTaq®Buffer 2.5 µL，EasyTaq®DNA Polymerase 0.5 µL，dNTPs 2.0 µL，DNA 模板2.0 µL，ddH2O 17.0µL。PCR 扩增程序是94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，退火温度57 ℃ 1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 个循环，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上检测，凝胶成像仪上拍照。

表1 引物信息

1.2.4 根结线虫种类的统计方法

根据根结线虫分子生物学鉴定结果，统计15个葡萄品种中根结线虫的种类。

2 结果与分析

2.1 葡萄根结线虫病的症状

在葡萄育苗圃中，苗木感病严重，除‘抗砧3号’外，其余14 个葡萄品种的苗木均受根结线虫为害。葡萄苗木感病后，地上部表现出植株矮化、生长发育不良、叶片黄化且失去光泽的症状（图版4-A-a），地下部根部畸形，形成瘤状根结。

不同葡萄品种苗木感病症状表现不同，如代表性葡萄品种‘美乐’，感病后地上部表现出枝梢短弱、叶片卷曲的症状，地下部根稍膨大，根系形成大小不等的根结，外表光滑（图版4-A-b）；代表性葡萄品种‘霞多丽’，感病后地上部表现出生长势弱，未有其他明显症状，地下部形成畸形的瘤状根结，相互连接成串珠状，外表粗糙（图版4-A-c）。

2.2 根结线虫形态学鉴定

（1）南方根结线虫的鉴定。2 龄幼虫：蠕虫形，头冠明显、较窄、前端凸平，头部与虫体分界不明显，口针纤细，中食道球椭圆形，尾尖钝圆，尾端透明区末端界限明显（图版4-B-a～c）。雌虫：乳白色，虫体呈梨形，唇区凸起，口针锥体尖端钝圆，口针锥部向背面弯曲明显，口针基球扁圆形，中食道球近似为圆形（图版4-B-d）。雌虫会阴花纹：卵圆形，背弓高，近似梯形，顶部平，背纹紧密，背面和侧面的线纹呈平滑的波浪形，阴门与肛门之间无线纹（图版4-B-e）。鉴定为南方根结线虫（M.incognita）。

（2）花生根结线虫的鉴定。2 龄幼虫：蠕虫形，头冠明显、前端平，口针纤细，中食道球近似圆形，尾尖尖圆，尾部透明区末端无明显界限（图版4-B-f～h）。雌虫：乳白色，虫体呈梨形。唇区略有突起，口针锥部稍向背面弯曲，口针基球近似球形，中食道球椭圆形（图版4-B-i）。雌虫会阴花纹：卵圆形，背弓较低，扁平至圆形，线纹粗、平滑且连续，背面和侧面的线纹稍呈锯齿状，侧面的线纹有时分叉，部分线纹从两侧弯向阴门（图版4-B-j）。鉴定为花生根结线虫（M.arenaria）。

2.3 根结线虫分子生物学鉴定

2.3.1 根结线虫mtDNA-PCR 扩增

选用通用引物C2F3/1108 对140 头根结线虫的DNA 进行mtDNA-PCR 扩增。结果表明，14 个葡萄品种中的根结线虫，能扩增出2 种目标条带，条带的位置分别在1 100 bp 和1 700 bp。在葡萄品种‘赤霞珠’‘马瑟兰’‘黑比诺’‘西拉’‘阳光玫瑰’‘红芭拉蒂’‘大青’‘贝达’‘霞多丽’中，均扩增出2种目标条带（图1-a～i）；在葡萄品种‘美乐’‘品丽珠’‘无核翠宝’‘夏黑’‘爱神玫瑰’中，均只扩增出1 种目标条带（图1-j～n）。

2.3.2 根结线虫SCAR 特异性检测

根据mtDNA-PCR 扩增的结果，分别用特异性引物MI-F/MI-R和Far F/Far R对根结线虫的种类进行SCAR 特异性检测。结果表明，目标条带位置在1 700 bp 的DNA，经引物MI-F/MI-R 可以扩增出955 bp 的目标条带，与南方根结线虫（M.incognita）一致（图2）。目标条带位置在1 100 bp 的DNA，经引物Far F/Far R 可以扩增出420 bp 的目标条带，与花生根结线虫（M.arenaria）一致（图3）。由此得出为害葡萄育苗圃中苗木的根结线虫是南方根结线虫（M.incognita）和花生根结线虫（M.arenaria），其中南方根结线虫（M.incognita）为优势种群，占根结线虫群体的88.57%。

图1 不同葡萄品种中根结线虫的mtDNA-PCR 扩增结果

图2 南方根结线虫特异性引物MI-F/MI-R PCR 扩增结果

2.3.3 不同葡萄品种中根结线虫的鉴定结果

图3 花生根结线虫特异性引物Far F/Far R PCR 扩增结果

由表2 可知，不同葡萄品种感染根结线虫的种类与数量不同，其中南方根结线虫（M.incognita）可以侵染所有的感病葡萄品种，在‘美乐’‘品丽珠’‘无核翠宝’‘夏黑’‘爱神玫瑰’中所占数量比率为100%；在‘赤霞珠’‘马瑟兰’‘黑比诺’‘西拉’‘阳光玫瑰’‘红芭拉蒂’‘大青’‘贝达’中所占数量比率均大于70%；仅在‘霞多丽’中所占数量比率较低，为40%。结果表明，在葡萄育苗圃中，南方根结线虫（M.incognita）对葡萄苗木的侵染能力要明显强于花生根结线虫（M.arenaria）。

表2 15 个葡萄品种中根结线虫的分子鉴定结果

3 讨论与结论

形态学鉴定是根结线虫种类鉴定的传统方法，通常以雌虫会阴花纹形态特征，口针特征，食道球特征，2 龄幼虫和雄虫的头部、尾部特征，整体形态等形态特征为依据进行鉴定。赵洪海等[9]通过根结线虫的形态特征和雌虫会阴花纹，鉴定出山东省葡萄上的病原线虫是南方根结线虫（M.incognita）。然而，根结线虫的形态特征受寄主与环境等多种因素的影响，仅依靠形态学鉴定会导致鉴定结果有误。近年来，分子生物学鉴定技术发展迅速，因其具有高效性、精确性的特点，广泛应用于根结线虫的鉴定工作。如龙海波等[10]通过mtDNA 的序列分析以及构建系统发育树的方法鉴定出海南省蔬菜作物上的根结线虫是象尔豆根结线虫（M.enterolobii）。但由于分子生物学鉴定技术起步较晚，致使已获得序列的根结线虫种类较少，且部分序列在根结线虫种内及种间存在一定范围的变异[11]。因此，将形态学鉴定与分子生物学鉴定相结合，可有效避免因鉴定方法单一而产生的误差，使鉴定结果更加准确、可靠。如Aydinli 等[12]通过雌虫会阴花纹和SCAR 特异性鉴定技术鉴定出土耳其中部地区危害茄子的病原线虫是埃塞俄比亚根结线虫（M.ethiopica）。本研究采用形态学鉴定（雌虫、2 龄幼虫的形态特征和雌虫会阴花纹）和分子生物学鉴定（mtDNA-PCR 和SCAR 特异性检测）相结合的方法，鉴定出葡萄育苗圃中根结线虫的种类是南方根结线虫（M.incognita）和花生根结线虫（M.arenaria）。

马艳粉等[13]研究发现，根结线虫对不同寄主植物的侵染能力存在显著差异。本研究发现，在葡萄育苗圃所有的感病品种中，仅在少数几个葡萄品种上发现花生根结线虫（M.arenaria），所占的数量比率普遍较低，均小于60%。反之，南方根结线虫（M.incognita）可侵染所有的感病葡萄品种，所占比率较高，除‘霞多丽’外均大于50%。表明该地区两种根结线虫对葡萄的侵染能力差异明显，其中南方根结线虫的侵染能力最强。胡先奇等[14]研究发现，根结线虫对寄主植物的侵染能力与根结线虫种间的致病性差异有关。由此可知，南方根结线虫（M.incognita）对葡萄具有较强的致病性。此外，影响根结线虫侵染能力的原因还与寄主植物品种间的抗性有关。如张怀军等[15]研究发现，根结线虫对不同番茄品种侵染能力的差异与番茄品种间的抗性密切相关。然而目前关于根结线虫对葡萄致病性机理及抗性机制的研究较少，需进一步探究。

本研究还发现，‘抗砧3 号’免疫根结线虫病，这与刘三军等[16]发现的‘3309P’‘5BB’‘抗砧3 号’等砧木品种抗根结线虫病的结果一致，为选育抗根结线虫病的葡萄苗木提供了基础。但由于时间的局限性，本研究仅以永宁县葡萄根结线虫病害调查为基础，鉴定了该地区育苗圃中根结线虫的种类，而对整个贺兰山东麓葡萄酒产区中根结线虫的种类分布与所占的数量比率还无法判定。今后，对产区内其他葡萄种植地是否存在根结线虫为害的问题，需进一步调查研究。