枯草芽孢杆菌LF17 与甲基硫菌灵协同防治苹果树腐烂病的效果研究*

殷 辉，周建波，吕 红，秦 楠，赵晓军

（山西农业大学植物保护学院，农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030031）

苹果树腐烂病是由黑腐皮壳属（Valsaspp.）病菌引起的一种枝干病害，在我国各个种植区均有发生[1]，其中V.mali为主要的致病种[2]。生产中主要依靠化学药剂防治苹果树腐烂病[3]，然而存在病疤复发率高[4]、病原菌抗药性[5]及果园环境污染等问题[6-7]。因此探索环境友好且具有良好效果的防治方法显得尤为重要。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类重要的生防资源，具有抑制多种植物病原菌的能力（如：Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Pseudomonassolanacearum、Valsaspp.等），对人畜无害、环境友好，备受国内外研究者的关注[8]。迄今，已发现枯草芽孢杆菌对苹果树腐烂病菌有较好抑制作用的菌株有BS-0728[9]、LZ-1201[10]、E1R-j[11]、LF17 等[4]。在众多优良菌株中，BS-0728 是屈指可数的成功开发并应用于防治苹果树腐烂病[12]的菌株。然而在生产实践中时常由于枯草芽孢杆菌的防效不稳定、发挥作用慢、易受环境影响等缺点而受到制约[4,8,12]。

有研究表明，枯草芽孢杆菌可与甲基硫菌灵[13]、嘧菌酯[14]、噻呋酰胺[15]、咪酰胺[16]等化学药剂联用，进而协同防治病害，既可提高枯草芽孢杆菌的稳定性和防效，又可减少化学药剂的使用量。由此，探索枯草芽孢杆菌与化学农药联合防治苹果树腐烂病具有重要的指导意义。本研究拟筛选具有协同作用的枯草芽孢杆菌与化学药剂组合，探讨枯草芽孢杆菌与化学药剂协同防治苹果树腐烂病的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisLF17，由山西农业大学植物保护学院果蔬菜病害课题组分离获得。使用NA 培养基，在28 ℃培养箱中培养菌株LF17[4]。

苹果树腐烂病菌Valsa maliJZ069，由山西农业大学植物保护学院果蔬菜病害课题组分离获得[17]。使用PDA 培养基，在22 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗的培养箱中培养。

95%甲基硫菌灵原药，山东西亚化学工业有限公司生产；97%苯醚甲环唑原药，杭州大阳化工有限公司生产；97.5%嘧菌酯原药，山东西亚化学工业有限公司生产。

1.2 枯草芽孢杆菌LF17和化学药剂对菌丝生长的抑制效果

将枯草芽孢杆菌LF17 接种于NB 培养基，置于28 ℃摇床150 r/min 培养3 d 后获得发酵液。用无菌水将发酵液稀释成菌含量为1.0×109cfu/mL 的母液[4]。采用菌丝生长速率法测定[18]，用无菌水稀释成不同系列浓度的菌悬液，吸取系列浓度菌悬液加入约45 ℃的PDA，充分混合均匀，制成含系列浓度枯草芽孢杆菌的PDA 平板（表1）。

表1 枯草芽孢杆菌LF17和化学药剂的最终系列浓度

将95%甲基硫菌灵原药溶于丙酮，配成1.0×104μg/mL 的母液。将97%苯醚甲环唑、97.5%嘧菌酯2 种原药分别溶于甲醇，配成1.0×104μg/mL 的母液。试验时用无菌水分别将3 种杀菌剂母液稀释成系列浓度药液，加至50 ℃左右的PDA 中，制备含系列浓度药液的PDA 平板（表1）。

采用菌丝生长速率法[17]测定菌丝对化学药剂的敏感性。将腐烂病菌的菌饼（直径0.5 cm）接种至含药PDA 中心，以不含药PDA 为对照，每个处理重复3 次。25 ℃培养3 d，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。

抑制率（%）=｛［（对照菌落直径-0.5）-（药剂处理菌落直径-0.5）］/（对照菌落直径-0.5）｝×100

采用SPSS 19.0 软件进行数据的统计分析。以化学药剂浓度的对数值为自变量（X），相对应的菌丝生长抑制率的机率值为因变量（Y），用回归法拟合出毒力回归曲线得到回归方程，进而求出有效抑制中浓度EC50值。

1.3 化学药剂对枯草芽孢杆菌LF17生物活性影响的测定

将3 种化学药剂分别配成浓度为50、100、150、200 mg/L 的含药NA 平板，将10 μL 枯草芽孢杆菌LF17 的菌悬液（1.0×109cfu/mL）滴在含药平板中央，用玻璃棒均匀涂布于NA 表面，每处理重复3次，以同等体积的无菌水为对照，28 ℃培养2 d 后检查菌体生长情况，统计菌落数量。

1.4 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵复配剂的毒力测定

依据1.3 试验结果，分别配制枯草芽孢杆菌LF17 和甲基硫菌灵2 种单剂的母液，浓度为1.36×107cfu/mL 和1.027 1 μg/mL。再将LF17 的菌悬液与甲基硫菌灵按体积比为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10分别配制复配剂，重复3 次。测量各个处理的菌落直径，计算平均抑制率、预期抑制率及毒性比率[19]。根据毒性比率值，判断不同配方的协同作用效果。毒性比率＞1，表示为增效作用；毒性比率＜1，表示为拮抗作用；毒性比率＝1，表示为相加作用[19]。

毒性比率＝实际抑制率/预期抑制率

预期抑制率（%）＝（枯草芽孢杆菌LF17 菌悬液EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率）+（甲基硫菌灵EC50剂量实际抑制率×配比中的百分率）

1.5 复配剂协同防治苹果树腐烂病的效果测定

采用烫伤接种测定离体枝条的防治效果[20]。选取2 年生背上枝，截成120 cm 的枝段，端口封蜡，自来水冲洗2 次后，用75%乙醇表面消毒，无菌水冲洗3 次。用铁钉帽（直径为0.50 cm）烫伤枝段树皮，每个枝段1 个烫伤口，在烫伤口处接种腐烂病菌菌饼（直径为0.50 cm），以无菌PDA 为对照、每个处理接种3 个枝条。在接种部位上方1～2 cm 处加1 块无菌水浸湿的脱脂棉，用塑料薄膜将其和接种体包扎好。接种的枝条扦插于含水量40%的无菌细沙中，在温度25 ℃、相对湿度40%条件下培养。

待伤口扩展后，挑选病斑扩展长度为（1.00±0.30） cm 的枝条进行离体枝条腐烂病菌抑菌试验。用小刀在病斑处刻线，深至木质部。纵横交错，距离约0.50 cm。将伤口刻好线后，用毛笔在烫伤部位分别涂抹LF17 菌悬液与甲基硫菌灵复配剂（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL，按体积比5∶5配制）、枯草芽孢杆菌LF17 单剂（浓度为1.36×107cfu/mL）、甲基硫菌灵单剂（浓度为1.027 1 μg/mL），以无菌水作为对照。接种后的枝条插入含水量约40%的无菌细沙中，于25 ℃保湿培养10 d，观察记录枝条的发病情况，测量病斑长度，计算防治效果、试验重复3 次[7]。

防治效果（%）=［（对照组病斑长度-处理组病斑长度）/对照组病斑长度］×100

田间防效试验：2018—2019 年的3 月进行田间防治试验，刮治时彻底刮除病组织，深至木质部，四周外延0.50 cm，尽量使刮治伤口纵长、横窄，切面光滑。刮除病组织后，分别涂抹上述配制好的枯草芽孢杆菌LF17 与甲基硫菌灵复配剂（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL，按体积比5∶5 配制）、枯草芽孢杆菌LF17 单剂（浓度为1.36×107cfu/mL）、甲基硫菌灵单剂（浓度为1.027 1 μg/mL）使其完全覆盖刮治后的伤口并外延1.50 cm，处理后每隔10 d再涂2 次。以无菌水作为对照，每个处理20 个病疤，3 个月后测量伤口愈合面积，次年调查病疤复发情况。愈合面积采用坐标图纸法测定，用1 张纸在伤口总面积部位外围和内部未愈合部位外围画外围线，然后把2 个周线描绘在单个方格为1 cm2的坐标图纸上，计算愈合面积、病疤复发率。

病疤复发率（%）=（复发病疤数/调查总病疤数）×100

数据采用Excel 2003 进行图表处理，并采用SPSS 17.0 软件进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌LF17 和3 种化学药剂对菌丝生长的影响

3 种化学药剂甲基硫菌灵、苯醚甲环唑、嘧菌酯对苹果树腐烂病菌菌丝的生长均有抑制作用。其中，苯醚甲环唑抑菌效果最好，EC50为0.309 4 μg/mL；嘧菌酯的抑菌效果最差，EC50为7.643 6 μg/mL；甲基硫菌灵的抑菌效果居中，EC50为1.027 1 μg/mL。枯草芽孢杆菌LF17 含菌量为1.0×105～1.0×109cfu/mL 时，对苹果树腐烂病菌均有一定的抑制作用，抑制率范围为21.3%～79.4%，其抑制中浓度为1.36×107cfu/mL（表2）。

表2 枯草芽孢杆菌LF17和3种化学药剂对苹果树腐烂病菌的毒力测定

2.2 3种化学药剂对枯草芽孢杆菌LF17生物活性的影响

在含5～100 μg/mL 甲基硫菌灵的NA 培养基上菌株LF17 能正常生长。3 种化学药剂中甲基硫菌灵与菌株LF17 的相容性最好，相比对照组的菌落数差异不显著；其次为苯醚甲环唑和嘧菌酯。当苯醚甲环唑和嘧菌酯浓度为50 μg/mL 时，相比对照组的菌落数显著减少；浓度为100 μg/mL 时，菌株LF17的生长受到显著影响（表3）。

表3 加入3 种不同浓度化学药剂枯草芽孢杆菌LF17 菌落的生长情况

2.3 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵复配对苹果树腐烂病病菌的联合毒力

枯草芽孢杆菌LF17 与甲基硫菌灵的相容性最好，将LF17 菌悬液与甲基硫菌灵（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL）按不同体积复配测定联合毒力。当菌株LF17 与甲基硫菌灵体积比分别为7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 时，复配剂具有增效作用，实际抑菌率分别为65.78%、79.25%、81.36%、60.22%、62.81%。其中，体积比为5∶5时增效作用最强，抑菌率最高，为81.36%，毒性比率为1.660 2（表4）。

表4 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵复配对苹果树腐烂病病菌的联合毒力

2.4 复配剂对苹果树离体枝条的保护作用

枯草芽孢杆菌LF17 菌悬液与甲基硫菌灵按体积比5∶5 配制的复配剂（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），对苹果树离体枝条的防治效果最高，为74.05%，显著高于单剂型枯草芽孢杆菌LF17和甲基硫菌灵的防效，二者分别为54.59%和46.98%（图1）；涂抹药剂的病斑要显著小于对照（图2），涂抹复配剂的病疤长度为1.16 cm，显著小于单剂型枯草芽孢杆菌LF17 和甲基硫菌灵，二者分别为2.03、2.37 cm（图1）。

图1 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵5∶5复配剂在离体枝条上对苹果树腐烂病的防治效果

图2 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵5∶5复配剂对离体枝条上病斑形成的影响

2.5 复配剂对苹果树腐烂病的田间防治效果

苹果树腐烂病病树施用枯草芽孢杆菌LF17 菌悬液与甲基硫菌灵按体积比5∶5 配制的复配剂（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），苹果树腐烂病的复发率为5.84%，显著低于单剂枯草芽孢杆菌LF17（1.36×107cfu/mL）和甲基硫菌灵（1.027 1 μg/mL）处理，二者的复发率分别为6.59%、13.65%；使用枯草芽孢杆菌LF17（1.36×107cfu/mL）与甲基硫菌灵（1.027 1 μg/mL）复配剂接种后，病疤愈合面积为9.56 cm2，显著高于单剂枯草芽孢杆菌LF17和甲基硫菌灵，二者病疤愈合面积分别为7.54、4.85 cm2（图3）。

图3 枯草芽孢杆菌LF17与甲基硫菌灵5∶5复配剂及单剂对苹果树腐烂病的田间防治效果

3 结论与讨论

本研究探索枯草芽孢杆菌与甲基硫菌灵复配协同防治苹果树腐烂病的作用。室内毒力测定及田间试验表明，枯草芽孢杆菌LF17 菌悬液与甲基硫菌灵按体积比5∶5 配制的复配剂（浓度为1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），对苹果树腐烂病菌的抑制有明显的增效作用，抑菌率为81.36%，防治效果为74.05%，复发率为5.84%，显著优于2 个单剂的防治效果。相比涂抹3%甲基硫菌灵糊剂（剂量125 g/m2），本研究复配剂中甲基硫菌灵的使用量减少约60%[21-22]。已有报道证实枯草芽孢杆菌与咪酰胺混配对苹果树腐烂病菌（V.mali）等的抑菌率达到100%[16]，枯草芽孢杆菌与甲基硫菌灵混配对茄腐镰孢菌（Fusarium solani）的抑菌率比单剂提高31%～44%[13]，枯草芽孢杆菌与化学药剂联用表现为协同增效作用[13,16]。因此，探索枯草芽孢杆菌与甲基硫菌灵协同防治苹果树腐烂病具有重要的指导意义，在稳定防治效果的同时还能减少化学药剂的使用量。

生产中主要采用刮治并涂抹化学药剂防治苹果树腐烂病，后期伤口愈合能力差，长期裸露易滋生病菌，病疤复发率高[4]。本试验使用刮治并涂抹甲基硫菌灵与菌株LF17 菌悬液复配剂防治苹果树腐烂病，病疤复发率为5.84%，伤口愈合面积为9.56 cm2，显著高于单独使用枯草芽孢杆菌或甲基硫菌灵。枯草芽孢杆菌菌悬液中含有能促进生长的物质，可以促进伤口愈合，进而降低腐烂病的复发[23]。

已有研究结果表明，甲基硫菌灵[13]、嘧菌酯[14]、噻呋酰胺[15]、咪酰胺[16]等与枯草芽孢杆菌联用可以起到协同作用，弥补生防菌发挥作用慢、田间防效不稳定等缺点，从而更好地发挥生物防治作用。但是，对于枯草芽孢杆菌与甲基硫菌灵协同增效的作用机制还有待于深入研究，从而为更好地利用枯草芽孢杆菌提供技术支撑。