RIP3/CaMKII信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响*

周 飞， 滕 林， 邹文博， 杨 俊， 丁家望， 李 松

（三峡大学第一临床医学院，宜昌市中心人民医院心内科，湖北宜昌443003）

炎症刺激因子（如肿瘤坏死因子α）触发的程序性坏死（necroptosis）是一种由死亡受体和配基启动、依赖于受体相互作用蛋白（receptor-interacting proteins，RIPs）活化介导的可调控性细胞坏死。RIPs 作为重要的信号分子启动和调控细胞应激反应，决定细胞走向凋亡、坏死或存活等不同命运，有2 个RIPs即RIP1 和RIP3 在程序性坏死通路中起到关键作用［1］。新近的证据表明，可以调控的程序性坏死在心肌细胞坏死的发生发展过程中起到重要作用，多种信号转导通路参与其中，包括RIP1-RIP3-混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domainlike protein，MLKL）通路和RIP3-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）-线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）通路等，然而其潜在的机制并未完全明确［2］。

病毒性心肌炎主要表现为心肌细胞变性坏死和氧化应激引起的一系列事件的发生，心肌细胞几乎没有修复、再生及增殖能力，心肌细胞的进行性坏死及心脏收缩或舒张功能障碍是影响其预后的重要因素。既往的研究认为心肌细胞的坏死是不可调控且被动的过程，我们的研究表明可以调控的程序性坏死是病毒性心肌炎心肌细胞坏死的主要方式，RIP1/RIP3坏死体介导的程序性坏死在病毒性心肌炎的发生发展中起到重要作用［3］。有研究表明，RIP3 在缺血再灌注心肌损伤模型中起到关键作用，通过介导CaMKII 磷酸化和抑制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）而减少心肌细胞程序性坏死，并且不依赖于 RIP1-RIP3-MLKL 通路［4］。本研究拟通过构建柯萨奇病毒B3（Coxsaekie virus B3，CVB3）诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠模型，从整体水平探讨RIP3/CaMKII 介导心肌细胞程序性坏死在重症病毒性心肌炎中的作用，以期为病毒性心肌炎的防治提供新的理论基础和治疗靶点。

材 料 和 方 法

1 动物

母乳喂养至4 周龄的SPF 级纯种近交系雄性BALB/c 小鼠由三峡大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（鄂）2008-0004，体重16～20 g。

2 主要试剂

嗜心性CVB3 Nancy 株系美国引进，由上海交通大学医学院药物研究所惠赠；抗CaMKII 抗体购自Cell Signaling Technology；CaMKII 的特异性抑制剂KN-93 购自Merck；ROS 的特异性抑制剂钛剂（titanium，Ti）购自Sigma；过氧化氢检测试剂盒购自Abcam；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司。

3 主要方法

3.1 CVB3 型心肌炎BALB/c 小鼠模型的建立及实验分组［5］取6 周龄雄性 BALB/c 小鼠，模型组腹腔内无菌接种1 000 倍半数组织培养感染剂量（50%tissue culture infectious dose，TCID50）的CVB3（0.2 mL）制作急性重症病毒性心肌炎动物模型；正常对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.2 mL；药物治疗组每只小鼠除腹腔注射CVB3（0.2 mL）外，4 h 后尾静脉注射不同的药物［KN-93（10 μmol/kg）和Ti（20 μmol/kg），均溶于0.1% DMSO］；药物对照组每只小鼠除腹腔注射CVB3（0.2 mL）外，根据不同药物剂量注射等剂量的0.1%DMSO；空白对照组小鼠无任何处理。以上小鼠腹腔及静脉注射药物治疗连续7 d。于第7 天检测小鼠血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）水平；第1、2 和4 周采用心脏超声技术评估心脏功能并测定30 d生存率。

3.2 心脏超声技术对心功能的测定 采用心脏超声技术测定左室心功能，即左室射血分数（ejection fraction，EF）、左室短轴缩短率（fractional shortening，FS）和左室收缩期内径（left ventricular internal diameter at systole，LVIDs），以评估重症病毒性心肌炎的诱导及其程度。

3.3 心肌组织坏死性标志物的检测 血清cTnI 水平分析在三峡大学第一临床医学院检验科检测完成，具体操作根据试剂盒说明。

3.4 CaMKII 蛋白表达的Western blot 检测 用蛋白裂解液及PMSF 裂解细胞低温离心后取上清，取20 μg蛋白样品，进行10%SDS-PAGE，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1 h；I 抗4℃过夜。将膜与碱性磷酸酶标记的抗IgG 抗体孵育，室温轻摇1 h，用图像分析软件测定各条带吸光度（A）以进行定量分析。

3.5 心肌组织过氧化氢含量的检测 各组实验小鼠处死后立即取约0.1 g 心肌组织，分别经液氮速冻后，于4℃破碎、加入预冷的PBS 研磨制备成为组织匀浆，然后以BCA 法测定总蛋白含量。实验前按试剂盒说明书建立过氧化氢标准曲线，取各组心肌组织匀浆（总蛋白3 μg），分别加入过氧化氢检测稀释液后，按试剂盒说明书进行操作，于570 nm波长检测A值并以标准曲线法进行过氧化氢浓度的确定。

4 统计学处理

所有数据采用SPSS 11.0软件包进行统计分析。计量数据用均数±标准差（mean±SD）表示。先进行数据的正态性检验（Kolmogorov-Smirnov 检验）和方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析及SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CaMKII 抑制剂KN-93 显著改善重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能和生存曲线

与正常对照组相比，病毒感染第7 天，CVB3 组小鼠血清cTnI 水平显著显升高（P＜0.01），提示心肌细胞受损严重，见图1A。CVB3 组小鼠存活率40%左右，提示模型为重症病毒性心肌炎，见图1E。加入KN-93 后，CaMKII 蛋白水平显著下降（P＜0.01），提示KN-93 对CaMKII 有显著的抑制作用，见图1F。病毒感染第 7 天，与 CVB3 组相比，CVB3+KN-93 组小鼠血清cTnI 水平显著下降（P＜0.01），提示KN-93 有显著的心肌保护作用，见图1A。第1、2 和4 周小鼠心脏超声检查提示，无论是EF、FS 还是LVIDs，CVB3+KN-93 组较CVB3 组均显著好转（P＜0.01）；其30 d的生存曲线也明显改善（P＜0.01），见图1B～E。

Figure 1.Protective effect of KN-93 on mice with severe viral myocarditis.A：the serum level of cardiac troponin I（cTnI）in each group；B～D：ejection fraction（EF），fractional shortening（FS）and left ventricular internal diameter at systole（LVIDs）in each group at 1，2 and 4 weeks（W）；E：Kaplan-Meier survival curves of each group；F：the protein expression of CaMKII detected by Western blot.Mean±SD. n=5. **P＜0.05 vs normal（N）group；＃P＜0.05 vs CVB3 group.图1 KN-93对重症病毒性心肌炎小鼠的保护作用

2 ROS 抑制剂Ti 对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能和生存曲线的影响

CVB3+KN-93 组小鼠心肌组织过氧化氢含量较CVB3 组显著下降（P＜0.01）；加入ROS 抑制剂Ti 后，CVB3+KN-93+Ti 组过氧化氢含量较CVB3+KN-93 组轻度下降（P＜0.05），见图2A。CVB3+KN-93+Ti 组与CVB3+KN-93 组血清 cTnI 水平无显著差异（P＞0.05），见图2B。CVB3+KN-93+Ti 组较CVB3+KN-93组的心脏功能和生存曲线均无明显改善（P＞0.05），见图2C～F。

Figure 2.Protective effect of Ti on mice with severe viral myocarditis.A：the content of H2O2 was measured in each group；B：the serum level of cardiac troponin I（cTnI）in each group；C～E：ejection fraction（EF），fractional shortening（FS）and left ventricular internal diameter at systole（LVIDs）in each group at 2 and 4 weeks（W）；F：Kaplan-Meier survival curves of each group.Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs CVB3 group；▲P＜0.05 vs CVB3+KN-93 group.图2 钛剂对重症病毒性心肌炎小鼠的保护作用

讨 论

程序性坏死作为一种新的细胞程序性死亡方式，在许多疾病的病理生理过程中发挥了重要作用，特别在急性炎症、缺血性损伤及病毒感染等急重症疾病中［6］。众所周知，病毒性心肌炎的发病机制主要是反复的病毒感染导致对心肌细胞的持续损害及其诱发的免疫炎症反应。胱天蛋白酶（caspase）是启动凋亡途径的关键蛋白，病理状态下ATP 不足以维持caspase 的功能，导致凋亡通路出现障碍，细胞很容易出现程序性坏死［7-8］。我们前期的研究表明，程序性坏死是病毒性心肌炎心肌细胞死亡的主要方式［9］。程序性坏死可以被多种途径所启动，RIP3 通过介导CaMKII 磷酸化导致mPTP 开放，介导钙离子内流，引起钙超载，从而导致心肌细胞的程序性坏死；CaMKII 的特异性抑制剂KN-93 有明显的心肌保护作用且安全可靠［10］。本研究发现，使用CaMKII 的特异性抑制剂KN-93 后，CaMKII 的蛋白水平显著下降，表明心肌细胞的程序性坏死受到显著抑制；并且这种抑制明显减少心肌细胞的坏死，我们通过1～4周的连续心脏超声观察到心肌细胞坏死的减少直接导致小鼠心脏结构和功能明显改善；这些改善最终导致其30 d 生存率明显提高。因此，这些数据表明在重症病毒性心肌炎模型中RIP3 通过CaMKII 介导的程序性坏死起着重要作用，但潜在的机制仍需进一步探讨。

众所周知，氧化应激在细胞坏死的发生发展中起到重要作用，涉及到坏死的各个环节［11］。已有研究表明，RIP3 不仅通过CaMKII 介导的磷酸化和自身磷酸化过程介导程序性坏死，CaMKII 还能通过激活ROS 的发生而导致心肌细胞坏死［4］。本研究发现加入 ROS 抑制剂 Ti 后，KN-93 组 H2O2水平虽有一定程度的下降，但并未明显较少心肌细胞的坏死，也没有改善小鼠的心脏功能和30 d生存曲线。这些数据表明加入Ti后ROS的轻度下降并没有带来预后的改善。但进一步的研究发现，即使没有Ti 的抑制，CVB3+KN-93 组较 CVB3 组 H2O2水平明显下降，提示KN-93 通过特异性抑制CaMKII 本身就能明显减少ROS 的产生，这说明本模型中小鼠的ROS 可能已被KN-93 大部分抑制。这些实验数据从正反两方面证实KN-93 除特异性抑制CaMKII 阻断RIP3 介导的程序化坏死外，还通过抑制ROS 的发生减少心肌细胞坏死。

综上所述，以上结果初步提示RIP3/CaMKII 信号通路在CVB3 诱导的重症病毒性心肌炎大鼠模型中起到重要作用，CaMKII 的抑制剂KN-93 通过阻断RIP3 的信号传导能够显著减轻心肌细胞损伤，显著改善心脏功能和生存曲线，其机制可能通过抑制CaMKII 磷酸化和ROS 产生而实现。这也提示我们RIP3/CaMKII信号通路在本模型中的重要作用，但具体的信号转导机制有待进一步研究。