基于Nrf2通路探讨阿里红三萜酸减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用*

古丽尼歌尔·阿布都米吉提， 沙依拜·沙比提， 丛媛媛， 帕丽达·阿不力孜

（新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830011）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）以弥漫性肺泡肺间质水肿，难治性低氧血症及非心源性肺水肿为特征［1-2］，与体内氧化应激（oxidative stress，OS）及炎症介质升高具有关联性［3］。氧化应激在体内产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可引起气道和血管重塑、侵袭肺间质导致肺水肿、对肺实质细胞造成氧化损伤等［4］。研究证实，氧化应激损伤主要建立在ALI 的发生发展过程中［5］。转录因子核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）信号通路是一条保护性转导通路，保护机体抵抗外界氧化应激反应［6］。未受刺激时，Nrf2与Kelch 样环氧氯丙胺相关蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）存在细胞质中，当Nrf2受到氧化应激时则与Keap1解离，Nrf2立即进入细胞核，与抗氧化反应元件结合，激活下游基因如抗氧化酶及Ⅱ相激酶的转录，进而表达一系列相关蛋白如血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等，发挥抗炎和抗氧化作用［7］。

阿里红为多孔菌科层孔菌属植物苦白蹄的子实体，具有止咳平喘、祛风利湿、消肿止痛的功效，民间常用于治疗肺炎、慢性支气管炎等疾病［8］。研究显示，阿里红的主成分之一三萜酸具有抗炎和抗氧化等药理作用［9］，但其是否对ALI具有保护作用鲜少见到报道。因此，本研究通过构建LPS诱导的ALI小鼠模型，探讨FOTa对ALI的作用及机制。

材 料 和 方 法

1 动物

60 只 SPF 级雄性昆明小鼠，6～8 周龄，体重为（20±2）g，购于新疆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SYXK（新）2018-0003，小鼠饲养于SPF级屏障环境，在室温（20～25℃）和湿度40%～60%的环境下自由摄食饮水。

2 主要试剂

阿里红药材购于自治区维吾尔医院，由新疆医科大学药学院天药/生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为阿里红（Fomes OfficinalsAmes）。地塞米松（dexamethasone，Dex）购自北京索莱宝科技有限公司；脂多糖（lipopolysoccharide，LPS）购自sigma；小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA 试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司；血气片购自IDEXX；逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；TaKaRa试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；兔源Keap1、兔源Nrf2 和兔源HO-1 抗体购自Abcam；兔源β-actin购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG 购自中杉金桥生物技术有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1 和β-actin 所用引物由上海生物工程有限公司根据设计合成，序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3 主要方法

3.1 FOTa 的提取及含量测定 根据参考文献［10］精密称定阿里红生药材粗粉（30 目）约220 g，置圆底烧瓶中，加入95%乙醇2.2 L，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，过滤，即得。采用紫外-分光光度法进行FOTa 的含量测定，即Y＝32.848X+0.0496，R＝0.9992，含量为33.5%，得率为15.9%。给药前，按照阿里红药材成人给药剂量［11］与折算系数 W 计算出 70 mg/kg、140 mg/kg 和280 mg/kg 3 个剂量，用氯化钠注射液各配成相应浓度的溶液。

3.2 动物分组及处理 将60 只雄性昆明小鼠按随机数表法分为6 组：对照（control）组、模型［12］组（LPS 5 mg/kg 组）、地塞米松［12］组（Dex 1 mg/kg 组）及FOTa 70 mg/kg、140 mg/kg和280 mg/kg 组，每组10只。FOTa 干预组连续灌胃相应浓度FOTa 4 周，其余组灌胃同等体积生理盐水，末次灌胃生理盐水后，Dex 组腹腔注射1 mg/kg，30 min后除对照组外，其余各组腹腔注射5 mg/kg LPS 进行造模。造模成功条件以处理动物当天PaO2/FiO2值与造模前后体重变化值来确定，即 PaO2：FiO2＜300 mmHg 与造模后体重骤降作为成功标志。造模后10 h，取血，脱颈处死小鼠，取左下肺叶检测肺湿/干重比值（wet/dry weight ratio，W/D），取左上肺叶放于4%多聚甲醛中固定用于病理切片，取右肺组织放置于-80℃储存备用。

3.3 小鼠血氧分压、二氧化碳分压及氧合指数分析 小鼠模型建立10 h 后，取小鼠腹主动脉血液标本行血气分析［2］。

3.4 肺组织W/D 检测 用滤纸轻轻吸干肺组织表面水分并置于称量瓶中精密称取湿重，在80 ℃干燥箱内烘烤48 h，精密称取干肺重量并按照C=W湿/W干计算肺组织的湿干重比。

3.5 试剂盒检测血清中氧化应激指标MDA、SOD和GSH-Px 含量 取血，在4 ℃，1006 ×g的条件下分离血清，按照ELISA 方法，实验中设置空白对照孔和标准品孔，采用说明书进行规范加样，最后选择450 nm波长检测A值，并根据标准品的吸光度值及相应的浓度值，制作标准曲线，根据标准曲线计算出待测样品的浓度值。

3.6 HE 染色观察肺组织病理学变化 将肺组织置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切成约5 μm 厚的薄片之后用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱水置换。按照标准程序进行苏木精-伊红染色，清洗、脱水、封片，于400 倍光学显微镜下观察组织病理学改变。分别以肺泡水肿、肺泡内充血、肺泡内充血、肺间质水肿程度评分：无改变或非常轻微为0 分，轻度改变为1 分，中度改变为2 分，重度改变为3 分，极重度改变为4 分，累计上述4 项的平均分值即为肺损伤评分［13］。

3.7 RT-qPCR 检测肺组织 Nrf2、Keap1 及 HO-1 的mRNA 表达量 肺组织用Trizol 法提取总RNA，按照试剂盒操作说明将RNA 逆转录为cDNA，RT-qPCR扩增条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40 个循环。用目的基因的Ct 值减去内参照的Ct 值，得出ΔCt 值，然后用待测组分的ΔCt 值减去正常组的ΔCt值，得出 ΔΔCt 值，采用 2-ΔΔCt分析方法分析目的基因表达量。

3.8 Western blot 检测肺组织中 Nrf2、Keap1 及 HO-1的蛋白表达量 取50～100 mg 肺组织在液氮中进行研磨，并立刻放入RIPA 缓冲液中，待组织与缓冲液充分反应后，离心取上清，用BCA 法进行蛋白定量，每孔等量加样，依次进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉溶液封闭，洗膜并依次加入到Keap1、Nrf2、HO-1（1：1000）和β-actin Ⅰ抗（1∶5 000），4℃孵育过夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗（1∶10 000）室温孵育60 min，洗膜，用增强化学发光（ECL）检测试剂盒显影。用ImageJ图像分析方法进行灰度值分析。

4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。数据结果均采用均数±标准差（mean±SD）表示，采用单因素方差分析结合多组间方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 FOTa 对ALI 小鼠血氧分压、二氧化碳分压及氧合指数影响

与对照组相比，模型组PaO2与PaO2/FiO2降低（P ＜0.05），PaCO2升高（P ＜0.05）；与模型组相比，FOTa-280 mg/kg 组 及 Dex 组 PaO2与 PaO2/FiO2升 高（P ＜0.05），PaCO2降低（P ＜0.05），见图1。

2 FOTa对ALI小鼠肺组织W/D的影响

与对照组相比，模型组的W/D 升高（P ＜0.05）；与模型组相比，FOTa-280 mg/kg组及Dex组的W/D降低（P ＜0.05），见图2。

3 FOTa 对小鼠血清中 MDA、SOD 和 GSH-Px 水平的影响

与对照组比较，模型组小鼠的MDA 水平升高（P ＜0.05），SOD 及 GSH-Px 水平降低（P ＜0.05）；与模型组比较，FOTa 280 mg/kg 组及Dex 组均能降低血清中 MDA 水平（P＜0.05），升高 SOD 及GSH-Px 水平（P＜0.05），见图3。

4 FOTa对小鼠肺组织病理学的影响

结果显示，对照组肺组织结构清晰，肺泡结构未见明显异常；模型组肺泡腔和间质可见大量红细胞渗出，并伴有肺间质水肿、肺泡结构被破坏、肉眼见片状血灶；FOTa-280 mg/kg组及Dex组肺组织红细胞浸润明显减少，肺泡结构有所改善，肺间质水肿减轻，片状血灶明显减少，与对照组相比，模型组肺组织损伤评分升高（P＜0.05）。与模型组相比，FOTa-280 mg/kg 组及Dex 组肺组织损伤评分降低（P＜0.05），见图4、5。

Figure 1.The effect of FOTa on indexes of arterial blood gas analysis in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图1 FOTa对ALI小鼠动脉血中血气分析相关指标的影响

Figure 2.The effect of FOTa on the wet-to-dry weight ratio（W/D）of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图2 FOTa对ALI小鼠肺组织湿干重比例的影响

5 FOTa 对 ALI 小鼠肺组织 Nrf2、Keap1 及 HO-1 mRNA表达量的影响

与对照组相比，模型组Keap1 mRNA 表达水平升高（P＜0.05），Nrf2 与 HO-1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，FOTa-280 mg/kg 组及Dex组 Keap1 mRNA 表达水平降低（P＜0.01），Nrf2 与HO-1 mRNA表达水平升高（P＜0.05），见图6。

Figure 3.The effect of FOTa on the oxidative stress（serum MDA，SOD and GSH-Px levels）in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图3 FOTa对ALI小鼠血清中氧化应激水平的影响

Figure 4.Effect of FOTa on the histopathological changes of the lung tissue in ALI mice（HE staining，scale bar=50 μm）.图4 FOTa对ALI小鼠肺组织病理学改变的影响

Figure 5.Effect of FOTa on the lung injury score of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图5 FOTa对ALI小鼠肺组织损伤评分的影响

6 FOTa 对 ALI 小鼠肺组织 Nrf2、Keap1 及 HO-1蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组Keap1 蛋白表达水平升高（P＜0.05），Nrf2 与HO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，FOTa 低、中、高剂量组及Dex组 Keap1 蛋白表达水平均降低（P＜0.05），Nrf2 和HO-1蛋白水平升高（P＜0.05），见图7。

讨 论

ALI 以发病机制繁琐，病情进展迅猛为特点，被称为临床常见的危急重疾病之一［14］。研究显示，革兰阴性细菌感染引发脓毒症是ALI 的主要原因［15］，也因此而引发肺部炎症细胞的招募和浸润［16］。外膜是革兰阴性细菌细胞壁的主要致病因素，而脂多糖正是存在于外膜的内毒素主成分［17］，它在很大程度上可以模拟脓毒症和ALI。在动物模型中，因为气管注射可能伴有严重出血和坏死的可能性，因此通过腹腔注射以诱发 ALI［18］。

Figure 6.Effects of FOTa on the mRNA expression of Keap1，Nrf2 and HO-1 in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图6 FOTa对ALI小鼠肺组织Keap1，Nrf2及HO-1 mRNA表达的影响

Figure 7.Effect of FOTa on the Keap1，Nrf2 and HO-1 protein expression in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.图7 FOTa对ALI小鼠肺组织中Keap1、Nrf2及HO-1蛋白表达的影响

本实验中，W/D 升高及病理切片中大量红细胞渗出、片状血灶，可视为LPS 成功诱发了炎症反应。根据柏林定义［2］，将 PaO2：FiO2＜300 mmHg 称作为ALI。本实验血气指标显示，模型组小鼠PaO2：FiO2＜300 mmHg（PaO2/FiO2≈250，FiO2=0.21），PaCO2升高。而动脉血中PaCO2的升高严重影响了机体的换气功能。综合上述结果，该实验建立模型成功。给药组中，PaCO2明显降低说明机体换气功能有所改善。FOTa 对PaCO2的升高有了明显缓解作用，这可能是FOTa 抑制了肺部炎症反应，提高了血氧结合比，从而改善了肺部功能。

在LPS 诱导下，炎症细胞可通过浸润肺组织引发炎症因子聚集而诱发氧化应激反应［19］，外源性和内源性ROS介导的氧化应激是引发炎症介质和细胞损伤的重要因素［20］，其中，SOD 与 GSH-Px 两种酶在肺组织内源性抗氧化系统中起重要作用，而MDA 作为自由基脂质过氧化反应的最终产物，反映肺组织的损伤程度［21］。ELISA 法显示，模型组血清中 SOD与GSH-Px 浓度降低，此结果可能与LPS 引发的肺部氧化应激有关，而MDA 浓度升高也证明了这一结果。FOTa 的应用降低了MDA，升高了SOD 与GSHPx 的水平，从而阻止了氧化应激对正常肺组织细胞的损伤，降低了肺组织炎症细胞及红细胞浸润。

Nrf2 介导的信号通路是机体内维持氧化应激的重要信号通路。此外，研究表明Keap1 是氧化应激的关键传感器［22］。经LPS刺激，模型组中Keap1蛋白表达水平升高，此结果表明Keap1 参与了氧化应激反应的诱发。接着，在氧化胁迫下Nrf2 从Keap1 中释放出来，从而激活其在核中下游调控的基因—HO-1［23］。研究显示，HO-1 具有较强的抗炎作用［24］。根据本实验FOTa 增加HO-1 mRNA 及蛋白表达水平的结果推测FOTa 与HO-1 共同协调了抗炎作用。而Nrf2 通过调节抗氧化应激反应蛋白的功能来维持细胞稳态［24］。研究显示，Nrf2 未激活时体内的氧化应激反应水平极高，也是ALI 发展迅猛的时期［25］。给药组中FOTa 升高了Nrf2 的蛋白表达水平，表明当药物发挥保护作用时，Nrf2 是以激活的状态存在体内的。综上所述，Nrf2 信号通路参与了FOTa 减轻LPS诱导的小鼠ALI的病理生理过程。