体外肺癌上皮-间充质转化三维模型的建立及其对顺铂抵抗的机制研究*

徐 炜， 王 剑， 宋 嘉， 陈清勇

（中国人民解放军第903医院，浙江杭州310013）

既往研究表明，上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与肿瘤的恶性生物学行为、药物抵抗和复发密切相关［1-2］。然而在经典的肿瘤EMT及耐药性研究方面，目前仍主要采用二维细胞培养（two-dimensional cell culture，2DCC）及动物肿瘤模型。而随着肿瘤研究的不断深入，肿瘤微环境的重要性已备受人们关注［3］，由于二维培养缺少细胞外基质（extracellular matrix，ECM）环境，无法进行肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与微环境之间的交互研究；而动物实验周期较长，并且涉及到伦理道德、个体差异、免疫排斥和种属差异等问题，导致许多人类肿瘤模型无法在动物体内复制，而且动物实验最终呈现的是实验结果，但实验的中间过程是难以被观察的。

体外三维细胞培养（three-dimensional cell culture，3DCC）是介于动物实验与二维平面细胞培养之间的实验技术，该技术满足细胞培养的直观和条件可控性的基础上，尽可能模拟体内肿瘤细胞三维形态及功能，在模拟细胞与细胞之间、细胞与基质微环境相互作用方面具有独特的优势［4］。而体外肺癌三EMT 模型尚无文献报道，本研究拟采用三维培养技术在体外构建肺癌三维模型，并用转化生长因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）诱导形成三维EMT肺癌模型，并对其形态、蛋白表达和药物敏感性进行研究，揭示三维培养肺癌细胞发生EMT 和顺铂抵抗的分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞株 人非小细胞肺癌细胞系95D 购自中科院上海细胞生物研究所。

1.2 主要试剂 胎牛血清和RPMI-1640 培养液购自 Gibco；TGF-β1 购自 PeproTech；顺铂注射液购自齐鲁制药公司；琼脂购自Gene；氯化钙颗粒（分析纯）购自天津市永大化学试剂有限公司；海藻酸钠购自Sigma；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、AKT、mTOR、p-AKT 和 p-mTOR 抗体均购自 Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗体购自Abcam；羊抗兔IgGⅡ抗购自杭州联川生物有限公司；荧光羊抗兔IgGⅡ抗购自Jackson ImmunoResearch。

2 方法

2.1 细胞培养 95D 细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（终浓度为1×105U/L）和链霉素（终浓度0.1 mg/L）的 RPMI-1640 培养液，常规置于37℃、5%CO2培养箱中，取对数生长期细胞实验。

2.2 细胞支架制备 支架材料为琼脂和海藻酸钠混合物，材料终浓度为5%，外形为半径4 mm、高度2 mm 的圆柱形米黄色干燥薄片。前期研究结果表明，该种材料的细胞支架具有无毒、生物兼容性好、降解率低、内部孔隙率高、细胞成球快、成球率高等优点［5］，可用于肺癌细胞三维培养。

2.3 细胞接种 支架在95%乙醇中浸泡1 h 后，用无菌镊子转移将支架至24 孔板中，超净台内紫外线照射2 h，室温下晾干，调整细胞浓度为5×108/L，取40 μL 细胞悬液，轻轻添加到支架上，37℃孵育45 min之后加入1 mL培养液，每24 h换液一次。

2.4 EMT 模型诱导及细胞形态观察 细胞在支架上培养96 h 后基本形成细胞球，此时将培养液更换为含有 5 μg/L TGF-β1、0.5 μmol/L LY294002 或 10 nmol/L rapamycin 的培养液继续培养3 d，每24 h换液一次。每日用荧光倒置显微镜观察细胞形态变化。72 h 后将支架取出，PBS 柔和漂洗3 次，4%甲醛固定24 h，梯度（50%→75%→95%→100%→100%）乙醇脱水，每次脱水15 min，室温干燥12 h 后将样品固定在导电台上，表面喷金30 s 后在1.5 kV 电压下用扫描电镜观察细胞形态。

2.5 激光共聚焦观察蛋白表达 弃掉培养液，用PBS 洗 2～3 次，每次 5 min。加 1 mL 浓度为 4% 多聚甲醛，固定细胞，室温30 min。弃掉固定液，加PBS清洗3 次，每次5 min。弃液后加入1 mL 0.1%Triton X-100，室温透膜 15 min。弃液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。5%PBS脱脂乳封闭1 h。加Ⅰ抗，4℃孵育过夜，弃液后加PBS清洗3次，每次5 min。加荧光Ⅱ抗，避光孵育1.5 h，弃液后加PBS 清洗3 次，每次5 min。DAPI 染色 15 min，弃液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。用镊子挑起支架，用锐器轻轻刮下支架表面细胞至玻片上，盖上盖玻片后，再用激光共聚焦显微镜观察。

2.6 MTT 法检测三维培养细胞对顺铂的敏感性将支架均匀裁剪成4 份，95%乙醇浸泡消毒后，用无菌镊子将支架转移至96 孔板。调整细胞浓度为5×108/L，取10 μL 细胞悬液，轻轻添加到支架上，孵育30 min 后，加入含有 10%FBS 的培养液，每 24 h 换液1 次。待培养96 h 后，三维培养EMT 组更换为含有5 μg/L TGF-β1 的培养液和顺铂浓度分别为0、2、4、8、16和32 μmol/L 的培养液；三维培养组加入顺铂浓度分别为0、2、4、8、16和32 μmol/L的培养液，继续培养3 d，每24 h 换液1 次。两组均设5 个复孔，待培养结束后，于各孔加人20 μL MTT 溶液（5 g/L，无菌PBS配制），37℃温箱孵育4 h，弃培养液，各孔加入150 μL 二甲基亚砜，摇床避光轻摇10 min，96 孔板离心机低速离心（200×g，5 min），分离支架与上清液，每孔吸100 μL 上清液置于另一96 孔板内，酶标仪在490 nm 处检测A值，绘制细胞活力抑制率曲线，其中横坐标为药物浓度（μmol/L），纵坐标为细胞活力抑制率（%）。

2.7 Western blot 检测蛋白表达 收集细胞并加入裂解液充分裂解，低温高速离心（4℃，13 800×g，15 min），提取上清-80℃保存。BCA 法检测蛋白浓度，煮沸变性后每个泳道加入总蛋白10 μg，8% SDSPAGE 分离后，转印（300 mA，120 min）到 PVDF 膜上。5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白室温封闭1 h。洗膜后加入Ⅰ抗，4℃孵育过夜。Ⅱ抗（1∶3 000）孵育1.5 h 后洗膜，加入ECL 发光液，凝胶成像系统照相，用ImageJ软件分析条带灰度值。

3 统计学处理

以上实验均至少重复3 次。应用SPSS 13.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），两两比较采用 Bonferroni 校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TGF-β1促进三维培养95D细胞EMT

倒置荧光显微镜结果显示，三维培养95D 细胞呈聚集生长，细胞无伪足，细胞球表面较为光滑，细胞球之间存在明显的界限；当加入TGF-β1 后，原本表面紧实的细胞球出现了细胞离散、迁移，见图1。

扫描电镜结果显示，三维培养95D 细胞呈球形生长，细胞球表明圆滑，而在TGF-β1 刺激后，细胞球出现了塌陷，细胞间的黏附不再紧密，底部细胞有细小伪足出现，细胞向周围迁移，见图2。

激光共聚焦显微镜观察显示，TGF-β1刺激后E-cadherin 蛋白表达无明显变化，而N-cadherin 和vimentin蛋白表达上调，见图3。

Western blot 显示，TGF-β1 刺激后 E-cadherin 蛋白表达下调（P＜0.01），而N-cadherin 和vimentin 蛋白表达上调（均P＜0.01），见图4。

Figure 1.The effect of TGF-β1 on the morphological changes of three-dimensionally cultured 95D cells observed by inversed fluorescence microscopy（scale bar=200 μm）.A：control group；B：TGF-β1 group.图1 倒置荧光显微镜观察TGF-β1 对三维培养95D 细胞形态的影响

Figure 3.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells observed by laser confocal microscopy（scale bar=100 μm）.A，D：E-cadherin；B，E：N-cadherin；C，F：vimentin.A～C：control group；D～F：TGF-β1 group.图3 激光共聚焦显微镜观察TGF-β1 对三维培养95D 细胞蛋白表达的影响

2 LY294002 和 rapamycin 逆转 TGF-β1 诱导的三维培养95D细胞EMT

荧光倒置显微镜观察显示，PI3K 抑制剂LY294002 及 mTOR 抑制 剂 rapamycin 可显 著 抑制TGF-β1刺激后细胞球的离散和迁移，见图5。

Figure 4.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells detected by Western blot.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group.图4 Western blot检测TGF-β1对三维培养95D细胞蛋白表达的影响

Figure5.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced mesenchymal phenotype of three-dimensionally cultured 95D cells.A：control group；B：TGF-β1 group；C：TGF-β1+LY294002 group；D：TGF-β1+rapamycin group.Scale bar=200 μm.图5 LY294002和rapamycin逆转TGF-β1诱导三维培养95D细胞的间充质表型

Western blot 结果显示，与 control 组比较，TGF-β1 处理三维培养95D细胞可诱导AKT和mTOR磷酸化水平升高（P＜0.05），同时E-cadherin 表达下调（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表达上调（P＜0.01）；与TGF-β1 组比较，LY294002 可抑制 AKT 和 mTOR 磷酸化（P＜0.05），上调E-cadherin 蛋白表达（P＜0.05），下调 N-cadherin 和 vimentin 表达（P＜0.01）；与 TGF-β1 组比较，rapamycin 不能抑制 AKT 磷酸化（P＞0.05），但可抑制 mTOR 磷酸化（P＜0.01），上调 E-cadherin 蛋白表达（P＜0.05），下调 N-cadherin 和 vimentin表达（P＜0.01），见图6。

3 LY294002 和 rapamycin 逆转 TGF-β1 诱导的三维培养95D细胞顺铂抗性

MTT 结果表明，TGF-β1 可增强三维培养 95D 细胞对顺铂的抵抗，而LY294002 和rapamycin 可逆转这一现象；计算 IC50值显示，与 TGF-β1 组［（8.42±0.61）μmol/L］相比，空白组［（6.12±0.54）μmol/L］、LY294002 组［（6.34±0.28）μmol/L］和 rapamycin 组［（6.56±0.03）μmol/L］95D 细胞对顺铂的敏感性均较高（P＜0.01），见图7。

讨 论

肺癌已成为死亡率最高的肿瘤，转移和耐药是肺癌治疗失败的重要原因之一，而EMT 与此密切相关［6］。目前关于EMT 的研究基本停留在二维细胞培养模型层面，与二维模型相比，三维培养可以更好地模拟肿瘤微环境，促进细胞外基质的形成，提供更准确的扩散率和细胞形态学特征［7］。从本质上讲，三维培养具有与体内相似的肿瘤条件。例如，它们表现出缺氧区、静止区（干细胞样）和增殖细胞区、电化学梯度以及细胞-细胞和细胞-微环境相互作用，这与实体肿瘤微环境相似［8］。

三维培养条件下EMT发生时细胞形态是与二维培养不同。EMT 发生后，细胞球可长出鹿角样和树枝样的“触角”，这些“触角”是由多个细胞构成管状三维结构，可向周围侵袭生长［9］。在蛋白表达方面虽也表现为E-cadherin 下调，vimentin 和N-cadherin等蛋白上调，但与二维培养条件下发生的EMT相比，同种细胞在三维培养条件下发生EMT时表现出偏向于上皮形态，即更高的E-cadherin 和更低的vimentin表达，并且具有类似肿瘤干细胞的特性，这种特性是二维培养细胞不具备的［10］。

Figure 6.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transformation and activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in three-dimensionally cultured 95D cells.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.图6 LY294002和rapamycin逆转TGF-β1诱导的三维培养95D细胞上皮-间充质转化及PI3K/AKT/mTOR 通路活化

三维培养条件下构建EMT 模型的报道极少，主要受培养方法、生物材料和细胞本身对三维环境及诱导因子敏感性等因素的影响，因此构建EMT 模型较难。例如Pal 等［11］观察不同生物材料对肿瘤细胞EMT 的诱导作用，结果显示细胞接种在聚乳酸-乙醇酸［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］和明胶甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamide，GelMA）混合材料支架后，相比单用这两种材料更易诱导细胞发生EMT。Essid等［12］采用无血清悬浮培养方法获得肿瘤细胞球，再用EGF 和FGF 等细胞因子和低氧条件诱导头颈部鳞癌细胞发生EMT，而常氧和正常血清条件可逆转EMT 过程。然而上述实验方法构建EMT模型耗时较长，需3～14 d，过程也较为繁琐，此外上述研究多集中在细胞表型、蛋白表达，对功能及相关信号通路的研究较少。本研究期望采用一种快速、简便的方法构建体外肺癌三维EMT 模型，并对其表型、蛋白表达以及功能、信号通路进行研究。我们前期在3D 打印支架上培养肺癌95D 细胞可快速构建体外肺癌三维模型［5］，可在该研究基础上进一步探索EMT及药敏的分子机制。

Figure 7.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced resistance to cisplatin in three-dimensionally cultured 95D cells.A：the cell viability was detected by MTT assay；B：the IC50 values of each group.Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.图7 LY294002和rapamycin逆转TGF-β1诱导的三维培养肺癌95D细胞顺铂抗性

我们前期的预实验表明，95D 细胞在二维培养条件下，对TGF-β1 刺激无反应，但在三维培养条件下有明显反应，12 h 即可观察到细胞球离散现象，这表明三维环境可改变细胞的生物学行为。在加入TGF-β1 刺激 3 d 后，三维培养 95D 细胞球出现了明显的塌陷，细胞球中的细胞发生离散、迁移。电镜检测，加入TGF-β1 刺激后，细胞球底部的细胞生长出伪足，并向周围迁移。进一步用Western blot 验证显示，TGF-β1 刺激后的三维培养95D 细胞出现了E-cadherin 下调，N-cadherin 和 vimentin 上调，表明确实发生了EMT，与激光共聚焦观察到的结果基本一致。

既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信号通路与肿瘤EMT 及耐药密切相关［13］，但在三维培养条件下是否有影响需进一步探究。本实验结果显示，与对照组相比，EMT组的p-AKT和p-mTOR蛋白表达显著高于对照组，而加入PI3K及mTOR抑制剂后，p-AKT、pmTOR 蛋白表达较EMT明显下降，并且EMT被逆转，表现为 E-cadherin 上调，N-cadherin 和 vimentin 下调，细胞球未出现细胞离散现象。这表明TGF-β1 诱导三维培养肺癌细胞发生EMT 可能是通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路实现的。MTT 结果显示，发生EMT 的三维培养95D 细胞对顺铂的敏感性显著低于对照组，而加入PI3K及mTOR抑制剂后，可重新增强三维培养95D 细胞对顺铂的敏感性，进一步凸显了PI3K/AKT/mTOR 信号通路在三维培养细胞对药物抵抗机制中的作用。

综上所述，本研究在3D 打印技术构建体外肺癌三维模型基础上利用TGF-β1 成功将其诱导为EMT模型，该方法具有简单、快速成型、条件可控等特点，并且发现三维培养肺癌细胞发生EMT及对顺铂抵抗可能是通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路实现的。这一新型的体外肿瘤模型可为肿瘤转移和药敏研究提供有力工具。