乳酸链球菌素诱导氧化应激促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡*

张 晴， 李泳祺， 孙小涵， 叶露雯， 闫勇勇， 黄庆东， 侯 丹

（广州医科大学附属口腔医院实验室，广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广州医科大学口腔医学院口腔基础医学教研室，广东广州510182）

骨肉瘤是一类起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，在儿童和青少年中发病率较高，由于好发于血运丰富的干骺端，因此具有较高的肺转移率（约为10%～20%）和复发率，成为导致患者死亡的主要原因之一［1］。临床治疗主要以手术切除和化疗为主，术后患者5 年总体生存率由20% 提高到60%～70%［2-3］。尽管骨肉瘤治疗方案有所改善，但临床治疗仍面临诸多挑战，如化疗药物的毒副作用、肿瘤细胞的耐药性、肿瘤的复发及肺部转移等。

乳酸链球菌素（nisin）是乳酸链球菌（Lactococcuslactis）产生的低分子量五环抗菌肽，由34 个氨基酸残基组成，具有广谱抗菌活性和安全性［4］。1988年被食品和药品管理局FDA 批准用于食品防腐剂［5］。最近的研究发现乳酸链球菌素具有抑制多种肿瘤细胞（头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、结肠癌细胞和人星形细胞瘤细胞等）生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用［6-9］。然而，乳酸链球菌素对人骨肉瘤细胞的作用效果及其抗肿瘤的机制还不明确。本研究旨通过观察乳酸链球菌素对人骨肉瘤MG63细胞活力、凋亡及线粒体功能的影响，探讨乳酸链球菌素诱导的细胞凋亡与细胞氧化应激之间的关系，以期进一步明确其抗肿瘤的作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

乳酸链球菌素Z（3.8×107U/g）购自浙江银象生物工程有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）和0.25%胰蛋白酶购自Gibco；本研究所使用的抗体均购自Cell Signaling Technology；CCK-8购自日本同仁化学研究所；annexin V-FITC/PI试剂盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒［采用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）法］和5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide，JC-1）线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）购自碧云天生物技术研究所。人骨肉瘤细胞系MG63 购自中国科学院昆明细胞库。

2 实验方法

2.1 细胞培养 细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。

2.2 CCK-8 实验检测细胞活力 细胞传代接种于96孔板内，待细胞贴壁后，根据实验需要加入不同浓度药物，于细胞培养箱内培养，加药后24 h 加入CCK-8（每孔10 μL），继续放入培养箱孵育2 h 后，酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度（A）值。

2.3 流式细胞术及annexin V-FITC/PI 双染法检测凋亡 给予不同浓度的药物处理细胞后，使用不含EDTA 的胰酶收集细胞，经 PBS 洗涤后，加入 400 μL结合缓冲液重悬，加入Annexin V-FITC 染液避光孵育15 min，随后加入PI 染液避光染色5 min，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

2.4 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内的ROS 水平经不同浓度药物处理后，常规消化离心，重悬浮于DCFH-DA 浓度为 20 mol/L 的 PBS 缓冲液中，培养箱孵育20 min 后，PBS 洗涤细胞1 次，用无血清培养基重悬，流式细胞术检测细胞内ROS的水平。

2.5 JC-1荧光探针检测MMP 的变化 细胞经药物处理后，常规消化离心，加入JC-1 染色工作液（5 μmol/L），于培养箱中培养15 min，离心收集细胞，500 μL 孵育缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光，在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体形式，产生绿色荧光。

2.6 Western blot 检测凋亡相关蛋白的水平 细胞经药物处理后，裂解细胞，使用BCA试剂盒进行蛋白定量，加入上样缓冲液煮样变性，SDS-PAGE 分离后转膜，Ⅰ抗封闭过夜，次日Ⅱ抗室温封闭1 h，加入化学底物发光液，暗室曝光、显影、定影，拍照保存。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 作图，采用SPSS 21.0软件统计分析。实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），先检验方差齐性，若方差齐则各组均数间的两两比较采用Bonferroni 校正的t检验，若方差不齐则使用Dunnett T3 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 乳酸链球菌素对人骨肉瘤MG63 细胞活力及凋亡的影响

不同浓度（0、200、400、600 和800 mg/L）乳酸链球菌素处理骨肉瘤MG63细胞24 h，CCK-8实验检测乳酸链球菌素对细胞活力的影响。结果显示，当乳酸链球菌素的浓度达到400 mg/L 时，细胞活力显著降低（P＜0.01），随着给药浓度的增加，肿瘤细胞的细胞活力显著降低，呈浓度依赖性，见图1A。为进一步研究乳酸链球菌素是否可以诱导骨肉瘤细胞凋亡，使用annexin V/PI 染色及流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示，随着乳酸链球菌素浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，在600 mg/L 浓度时，细胞的凋亡率显著上升（P＜0.01），早期凋亡（annexin V+/PI-）和晚期凋亡（annexin V+/PI+）的细胞比例分别达到8.6%和68.3%，见图1B。Western blot 检测结果表明，经乳酸链球菌素处理骨肉瘤MG63细胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平显著升高（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax 与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值升高（P＜0.05），见图1C。

Figure 1.Nisin inhibited the viability and induced the apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on the cell viability（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2，and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 mg/L group.图1 Nisin抑制MG63细胞活力并诱导细胞凋亡

2 乳酸链球菌素诱导人骨肉瘤MG63 细胞内ROS生成增多和MMP下降

为研究乳酸链球菌素对MG63 细胞氧化应激的影响，本实验通过DCFH-DA 荧光探针检测不同浓度（0、400和600 mg/L）乳酸链球菌素处理骨肉瘤MG63细胞24 h后细胞内ROS水平的变化，结果显示，随着乳酸链球菌素浓度的增加，细胞内ROS 的生成逐渐增多（P＜0.01），见图2A。另外本实验使用JC-1 探针检测MG63 细胞经不同浓度乳酸链球菌素处理24 h后MMP 的变化，结果显示，随着给药浓度的增加，含有JC-1 单体的细胞比例逐渐增多（P＜0.01），且在浓度为600 mg/L 时，含JC-1 单体的细胞比例达到67.6%，表明MG63 细胞经乳酸链球菌素处理后，MMP显著降低，见图2B。

Figure 2.Nisin promoted reactive oxygen species（ROS）production and reduced mitochondrial membrane potential（MMP）in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells；B：effects of nisin（24 h）on the MMP.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mg/L group.图2 Nisin促进MG63细胞ROS产生，降低MMP

3 NAC 抑制乳酸链球菌素对人骨肉瘤MG63 细胞的促凋亡作用

使用不同浓度的（0、1、2 和5 mmol/L）抗氧化剂NAC 预处理 MG63 细胞 1 h 后，与 800 mg/L 乳酸链球菌素联合处理细胞24 h，CCK-8 法检测乳酸链球菌素对细胞活力的影响，结果显示，与单独乳酸链球菌素处理组相比，经NAC 预处理可以显著减弱乳酸链球菌素引起的MG63 细胞活力的降低（P＜0.05），并且当NAC 浓度为5 mmol/L 时抑制效果最为显著（P＜0.01），见图3A。同样地，使用5 mmol/L NAC 预处理细胞MG63 细胞1 h 后，联合不同浓度乳酸链球菌素处理细胞24 h，经annexin V/PI 染色及流式细胞术检测细胞凋亡率和Western blot 检测凋亡相关蛋白的水平。结果表明，与乳酸链球菌素单独处理组相比，NAC 预处理可以显著抑制乳酸链球菌素引起的细胞凋亡率的升高（P＜0.01），促进Bcl-2 的表达，显著降低cleaved caspase-3的蛋白水平（P＜0.01），Bax/Bcl-2的比值也显著降低（P＜0.05），见图3B、C。

4 NAC 降低乳酸链球菌素引起的MG63 细胞内ROS水平的增加，恢复MMP

经 5 mmol/L NAC 预处理 MG63 细胞 1 h 后，联合600 mg/L 乳酸链球菌素处理细胞24 h，DCFH-DA 荧光探针和JC-1 探针分别检测细胞内ROS 水平和MMP的变化，结果显示，与单独乳酸链球菌素处理组相比，NAC 预处理可减轻乳酸链球菌素引起的ROS水平的增加（P＜0.01），恢复降低的MMP（P＜0.01），见图4。

讨 论

乳酸链球菌素是一种天然无毒的低分子量抗菌肽，其抗菌作用机制明确，在食品防腐和胃及十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤病、结核病及乳腺炎临床治疗方面应用广泛［10-13］。近年来，越来越多的研究发现乳酸链球菌素可以抑制多种肿瘤的生长，如皮肤癌、头颈部鳞癌、结肠癌和人星形细胞癌等。本研究结果显示，乳酸链球菌素处理人骨肉瘤MG63细胞24 h后，呈浓度依赖性抑制细胞活性，促进细胞凋亡。

Figure 3.NAC attenuated nisin-induced apoptosis of MG63 cells.A：effects of nisin on cell viability（24 h）with NAC pretreatment（n=5）；B：effects of nisin（24 h）on apoptosis with NAC pretreatment（n=3）；C：the protein levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 after nisin treatment for 24 h with NAC pretreatment（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs respective nisin groups（without NAC pretreatment）.图3 NAC抑制nisin对MG63细胞的促凋亡作用

Figure 4.NAC reduced ROS production caused by nisin and restored the decreased MMP in MG63 cells.A：effects of nisin（24 h）on intracellular ROS level of MG63 cells with NAC pretreatment；B：effects of nisin（24 h）on the MMP with NAC pretreatment.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs nisin group（without NAC pretreatment）.图4 NAC降低nisin引起的MG63细胞ROS生成、恢复下降的MMP

机体在有氧代谢过程中会产生ROS，在正常的生理状态下，细胞内ROS 的产生和清除系统处于动态平衡状态。但在病理状态（如糖尿病）或抗肿瘤药物、重金属、紫外线辐射和空气污染物等外源因素刺激下，会诱导大量ROS产生，累积的ROS水平超过一定阈值，会导致细胞氧化应激，造成生物大分子和细胞器（如蛋白质、脂质、DNA 和线粒体等）损伤［14-18］。大量研究发现ROS的形成和积累在介导细胞凋亡中起着至关重要的作用［19］。线粒体是ROS 的主要来源，也是ROS 的主要攻击目标，ROS 大量产生使线粒体膜通透性改变，导致线粒体膜电位下降，促使线粒体通透性转换孔大量开放，细胞色素C 和凋亡诱导因子从线粒体内释放出来，最终触发caspase 级联反应导致细胞凋亡［20-23］。本研究结果发现，乳酸链球菌素可显著提高人骨肉瘤MG63 细胞ROS 的产生，降低线粒体膜电位，增加细胞凋亡率，在使用抗氧化剂NAC 后，乳酸链球菌素诱导的细胞内积聚的ROS 含量降低，线粒体膜电位基本恢复正常，细胞凋亡率显著降低，提示在乳酸链球菌素的作用下细胞出现了显著的氧化应激损伤。Western blot 结果显示，经乳酸链球菌素处理后，MG63 细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2 的比值显著升高，促凋亡蛋白cleaved caspase-3 的蛋白水平显著上调，进一步地，在联合使用NAC 后，Bcl-2 表达水平提高，Bax/Bcl-2的比值显著降低，cleaved caspase-3 的蛋白水平显著下降。由此，本研究推测，乳酸链球菌素可能通过促进细胞氧化应激、激活线粒体凋亡通路而发挥抗肿瘤作用。

综上所述，乳酸链球菌素可有效降低人骨肉瘤MG63 细胞活力，诱导细胞凋亡，此作用主要与其促进细胞内ROS 生成引发氧化应激作用，进而激活线粒体凋亡通路有关。本研究为抗菌肽类药物治疗肿瘤提供了理论依据。