Wnt1和LGR5在颅脑创伤后应激性溃疡大鼠胃黏膜中的表达变化*

周小嫔， 王衍廷， 刘 斌△

（1武警特色医学中心感染科，天津300162；2解放军联勤保障部队960医院神经外科，山东济南250000）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）可由于其神经系统功能改变引起应激性溃疡（stress ulcer），临床称为库欣溃疡（Cushing ulcer）［1］，其发生与TBI 的严重程度密切相关，即病情越重，其发生率越高。对于应激性溃疡的发生机制目前存在多种解释，其中主要有神经内分泌失调、胃黏膜保护功能损伤及胃黏膜损伤因子作用增强［2］，对应激性溃疡分子机制的阐释也有研究［3］。Wnt 信号通路的上游启动子Wnt1 及中心因子富含亮氨酸重复序列的G 蛋白偶联受体5（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，LGR5）与人体多种肿瘤发生密切相关，包括胃癌、肝癌、基底细胞癌、卵巢癌和食管癌等［4-7］。近年来发现这一信号通路也参与介导胃粘膜炎症性改变，导致攻击因子和/或防御因子失衡，进而诱发应激性溃疡［8］。本实验研究观察了Wnt1 和LGR5 在颅脑创伤后应激性溃疡大鼠胃粘膜中表达变化，进而探讨其与颅脑创伤后应激性溃疡的相关性，为临床阐释应激性溃疡发生机制及应激性溃疡的靶向治疗提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

免疫组化试剂盒（北京中衫金桥）；抗β-actin 抗体（Absmart）；抗LGR5抗体（Epitomics）；Ⅱ抗（KPL）；Trizol 试剂（Invitrogen）。电子皮质损伤撞击仪（electronic cortical contusion impactor，eCCI）和多普勒激光流量计（PF-5000，瑞典帕瑞医学公司）。

2 方法

2.1 实验动物及分组 SPF 级雄性7 周龄SD 大鼠30 只由解放军军事医学科学院动物实验中心提供，许可证号为SCXK（军）2007-004，体重（300±15）g。将大鼠编号、称重，随机分为3 组，即假手术（sham）组、轻度TBI（mild TBI，mTBI）组和重度TBI（severe TBI，sTBI）组，每组10只。

2.2 模型复制 （1）将sham 组大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔麻醉后固定于立体定向仪，头部备皮消毒，手术刀片沿正中切开头皮，剥脱分离骨膜，以牙科钻在冠状缝后5 mm、矢状缝右侧5 mm 交汇处，扩大骨窗至5 mm×5 mm，保持硬膜完整。（2）mTBI组大鼠重复上述操作，待夹尾反射出现后，将其固定于eCCI：设置打击深度2 mm，持续时间120 ms，打击速率3 m/s，打击 1 次。（3）sTBI 组大鼠待夹尾反射出现后，将其固定于eCCI仪：设置打击深度4 mm，持续时间120 ms，打击速率4 m/s，打击1次。

2.3 神经功能缺损评分（neurological severity score，NSS） eCCI 打击后待动物完全苏醒，由不了解实验分组情况、经过专业培训的研究人员分别在24和48 h两个时点参照 Wang 等［9］的 NSS 表，应用盲法对大鼠进行评分。大鼠出现平衡障碍、向轻瘫侧倾倒、抱紧平衡木肢体从平衡木垂落可认为是mTBI；sTBI在以上症状体征出现同时伴有耳廓反射、角膜反射和惊恐反射消失，甚至可以出现肌阵挛和肌张力障碍。

2.4 胃黏膜大体结构观察及HE 染色 造模后48 h，将大鼠处死，应用多聚甲醛灌流固定后，正中线开腹，游离胃组织，取胃组织沿胃大弯处剖开，生理盐水冲洗胃组织内壁残留物，直接肉眼观察胃黏膜皱襞情况。另取胃组织石蜡包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常规脱蜡，流水冲洗10 min 后，苏木素染色2 min。随后用流水冲洗10 min，伊红复染2 min，流水冲洗10 min，乙醇脱水，二甲苯两次透明，中性树胶封固。每张切片在100 倍显微镜视野下对胃黏膜进行观察。

2.5 Western blot 实验 eCCI 打击后 48 h 取材，选取大鼠胃黏膜3 个部位（胃大弯处、贲门部和幽门部），按100 g 组织样本加入100 μL 2× SDS 缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，1%SDS，50%glycerol，pH 6.8）的比例裂解样本，研磨后于冰上裂解10 min，12 000 r/min（离心半径8 cm）离心20 min，取上清液-80℃备用。BCA 试剂盒测定蛋白浓度后，取 50 μg 蛋白样品，经SDS-PAGE 分离后转至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭2 h，分别加入抗Wnt1 和LGR5 的Ⅰ抗，4℃过夜，洗膜后加Ⅱ抗，37℃孵育2 h。使用ECL 液显色，最后进行显影、定影，用Bio-Rad 凝胶成像系统扫描吸光度值，用Image-Pro Plus 6.0 软件进行分析。定量结果应用GraphPad Prism 6.0统计作图软件绘制。

2.6 免疫组织化学染色 造模48 h 后，应用兔超敏二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）进行免疫组化染色：大鼠胃组织切片用3%的H2O2封闭10 min 后，pH 6.0 的枸橼酸溶液加热孵育15 min 以修复抗原；冷却至室温后用5%的山羊血清室温封闭20 min；滴加抗LGR5 的Ⅰ抗（1∶150），4℃过夜；PBS 清洗后依次滴加试剂1 和2，室温孵育20min；DAB 显色剂显色，冲洗，苏木素复染，用乙醇脱水，再用二甲苯透明，最后中性树脂封片。在Nikon偏振光倒置显微镜下观察免疫阳性反应物的分布与定位。随机选取5 个不重复的视野，镜下计数形态完整的LGR5阳性细胞，计算各组阳性细胞平均数。

2.7 大鼠胃组织血流量的多普勒监测 致伤48 h后，各组取5 只大鼠，水合氯醛溶液腹腔麻醉后，行多普勒超声监测胃粘膜表面血流量，正中线剖腹，游离胃组织，插入激光血流仪探头，分别置于胃底部、胃大弯、贲门部和幽门部4 处测定胃黏膜表面血流量。各部位记录时间均为30 min，取平均值，单位为mL/（min×100 g）。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 统计作图软件进行分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较行单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 神经功能缺损评分的结果

如图1所示，sham组未伤及正常脑组织，神经功能未缺损，评分正常；mTBI 组及sTBI 组神经功能出现明显受损，主要表现为无法沿直线行走，平衡功能明显障碍，外周感知能力下降，NSS 均显著升高（P＜0.01），且sTBI 组较mTBI 组进一步升高（P＜0.01），提示sTBI 组大鼠神经功能损伤更重，即脑损伤程度更重。

Figure 1.NSS scores of the rats.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.图1 大鼠NSS评分

2 胃黏膜大体观察及胃黏膜HE染色结果

如图2所示，sham组可见胃黏膜呈淡红色，表面光滑，黏膜皱襞平整，黏膜上皮完整度好；mTBI组及sTBI 组均有不同程度胃黏膜组织损伤，表现为黏膜表面有血痂，部分胃黏膜表面可见散在不规则点状出血灶，sTBI 组还可见黏膜水肿及片状出血灶，部分黏膜可见皱襞变浅甚至消失。在光镜下可见sham组大鼠胃组织结构正常，黏膜表面完整，未见炎症细胞浸润渗出；mTBI组及sTBI组大鼠可见部分黏膜上皮萎缩，正常腺体结构出现萎缩，部分可见红细胞渗出，黏膜下层有炎症细胞浸润现象。

3 Wnt1和LGR5蛋白水平的变化

Western blot 结果显示，mTBI 组及 sTBI 组大鼠胃大弯、贲门和幽门处胃黏膜中Wnt1 和LGR5 蛋白表达水平较sham 组均显著升高（P＜0.05），且sTBI组Wnt1 和LGR5 蛋白表达水平较mTBI 组升高更明显（P＜0.01），见图3。

4 LGR5免疫组化染色结果

如图4 所示，LGR5 免疫阳性产物主要定位于胞浆中，sham 组免疫阳性产物也有表达但表达量较低（76±5），mTBI 组及sTBI 组的免疫阳性产物表达量均显著增多（P＜0.05），且sTBI 组（236±11）较mTBI组（178±11）显著增多（P＜0.05）。

Figure 2.The structure of gastric tissue and pathological changes of gastric body in each group（HE staining，×100）.Images g，h and I were the local enlarged views of d，c and f，respectively.图2 各组大鼠胃组织大体结构及胃组织胃体部病理变化

Figure 3.The protein expression of LGR5 and Wnt1 in gastric mucosa（great curvature，cardia and pylorus）of the rats detected by Western blot.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.图3 大鼠胃黏膜三个部位（胃大弯、贲门和幽门）胃组织LGR5和Wnt1

Figure 4.Immunohistochemical staining of LGR5 in the rat gastric mucosa tissues（×200）.Images a，b and c were the local enlarged views of A，B and C，respectively.LGR5 immunopositive products were mainly localized in cytoplasm.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.图4 大鼠胃黏膜组织LGR5免疫组织化学染色

5 胃黏膜多普勒超声血流量检测结果

如图5所示，sham组与2个TBI组胃大弯处血流量基本保持同一水平，而2个TBI组贲门部近胃小弯处黏膜血流量较sham组显著下降（P＜0.05），sTBI组血流量均值较mTBI 组下降更为明显（P＜0.05）。这一结果提示TBI 确实改变了胃黏膜组织的血流，降低了局部胃黏膜的血流量。

Figure 5.The measurement results of gastric mucosal blood flow by Doppler ultrasound.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.图5 多普勒超声检测胃黏膜血流量的结果

讨 论

近年来的研究表明，有关TBI 的实验多采用电子皮质损伤撞击仪造模，均报道了TBI 模型未见死亡［9］，造模成功后，大鼠胃组织大体观察及胃黏膜上皮HE染色可见，伤后大鼠胃组织宏观与镜下观察的确出现了胃黏膜的点状、片状出血灶，局部胃黏膜炎症细胞浸润［10］，红细胞渗出，腺细胞萎缩甚至消失，上皮细胞连续性中断，损伤深达黏膜下层组织，这印证了创伤后应激性溃疡发生的客观性，这种病变的机制可能是通过上调了Wnt1 及LGR5 的表达实现的，在TBI干预后，蛋白水平Western blot 证实大鼠胃黏膜中Wnt1及LGR5蛋白的表达上升，LGR5的免疫组化实验在细胞水平证实TBI 后LGR5 的异常高表达，且随着 TBI 严重程度增加，Wnt1 及 LGR5 的表达均出现上升趋势，证实了Wnt 信号通路相关蛋白高表达确实与TBI 的干预相关。本研究中mTBI 组及sTBI 组的胃黏膜血流量较Sham 组明显降低，这可能与TBI 干预后的血液再分布有关。近年来研究认为，胃黏膜血流量下降在应激性溃疡的发生中起主导作用［11］。局部胃黏膜的血流量充足是其保护性重要机制，TBI后使得黏膜血流量下降反过来又会导致黏液屏障完整性下降，从而加重溃疡病的出现，从实验中还可发现，这种局部血流量保护屏障作用损伤会随着TBI 程度加重而加重，既是创伤后应激性溃疡发生的原因又是结果。

以往大量的研究证实，Wnt 信号通路在肿瘤的形成和发展中起到重要调节作用［12］，例如各种消化道肿瘤，基底细胞癌，卵巢癌发生机制过程中都有Wnt 信号通路的作用。Wnt基因其实是一大基因家族，其中的Wnt1 在整个Wnt 信号通路中扮演启动子角色［13］。经典的Wnt信号通路转导途径主要以Wnt/β-cantenin 途径为主，其过程主要通过β-cantenin 向细胞核移位，激活TCF 转录活性，调节靶基因表达水平，这一重要靶基因即本研究中LGR5。LGR5 是具有18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，LGR5在人体多个组织结构中均有表达［14］，其作为Wnt 信号通路关键中心蛋白，在肿瘤研究领域备受关注，其异常表达或激活与肿瘤发生发展密切相关［15-16］。Sen 等［14］和 Polzer 等［17］的研究证实Wnt 信号通路介导了消化道黏膜损害过程以及参与一些慢性炎症疾病，如风湿样关节炎和动脉粥样硬化。激活的Wnt 联合下游靶基因LGR5介导了正常消化道黏膜组织修复、愈合和再生，很大程度上这一信号通路高表达会加重炎症反应，可能在消化道黏膜炎症进一步向消化道溃疡转化方面扮演重要角色［18］。这为创伤后消化性溃疡的发生机制提供了新的解释。

综上所述，本研究成功应用eCCI 建立了大鼠TBI后应激性溃疡模型，与国内外类似研究比较具有一定创新和先进之处。通过对Wnt信号通路中Wnt1及LGR5 在TBI 后出现高表达的研究，为颅脑创伤后应激性溃疡的发生机制提供理论依据，也为研究治疗TBI 后应激性溃疡的新型药物靶点研究提供实验依据。另外，本实验只研究了Wnt1 及LGR5 两个重要蛋白表达变化情况，对于Wnt1 及LGR5 所在Wnt通路的上下游因子相互作用的关系，还有待进一步研究探讨。