雌激素增强失血性休克大鼠肠系膜淋巴管的收缩功能*

张立民， 冯妞妞， 赵 晨， 张玉平， 牛春雨， 赵自刚△

（1河北北方学院微循环研究所/基础医学院，河北张家口075000；2河北医科大学基础医学院，河北石家庄050017）

失血性休克常见于多发性外伤、消化道溃疡、产科及手术意外等多种因素造成的急性大量出血；全球范围内，每年约有180 万重症患者死于失血性休克，其中有150 万为多发性外伤导致的失血性休克［1］。组织水肿及其引起组织缺氧进一步加重是重症休克患者死亡的最主要原因之一［2］；淋巴循环是组织液回流入循环系统的重要途径，淋巴管收缩性降低引起的淋巴管运输淋巴液的能力下降是重症休克发生组织水肿、导致休克难治的关键环节。雌激素具有多种生物学活性，对于失血性休克的心泵功能、免疫功能和血管反应性具有明显的改善作用，能显著延长失血性休克动物的存活时间［3-5］。研究也表明，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）可通过雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）降低失血性休克大鼠血管通透性，进而减少血浆渗漏、减轻组织水肿［6］。鉴于淋巴管收缩功能对于组织液回流的重要作用，雌激素是否可通过改善失血性休克后淋巴管的收缩功能、增加组织液回流进而发挥良好的抗休克作用，还不清楚。同时，淋巴管收缩功能与淋巴管平滑肌细胞（lymphatic smooth muscle cells，LSMCs）收缩过程中细胞内外钙离子浓度（［Ca2+］）变化（即钙瞬变）密切相关［7］，但雌激素对失血性休克淋巴管功能的调控作用是否与LSMCs 的钙瞬变有关，也不明了。因此，本研究通过观察活体淋巴微循环、离体淋巴管收缩性及LSMCs 内外［Ca2+］变化，评估E2 对失血性休克大鼠肠系膜淋巴管（mesenteric lymphatics，ML）收缩性的作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

成年雄性Wistar 大鼠，体重（300±20）g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［北京，许可证号SCXK（军）2012-0004］。大鼠在清洁动物饲养室适应性饲养一段时间后用于实验研究。饲养环境：温度（24±2）°C、湿度40%～60%、昼夜交替。

2 实验方法

2.1 实验分组与失血性休克模型的建立 大鼠随机分为假手术（sham）组、休克（shock）组和shock+E2组（n=6）。实验前，大鼠禁食12 h，自由饮水。实验过程中，首先应用V149407879 型小动物麻醉呼吸机（Midmark）吸入异氟烷诱导麻醉，肌肉注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg，Merck）全身麻醉，常规方法建立失血性休克模型，血压（40±2）mmHg 维持90 min，然后进行液体复苏（放出的全血与等量林格液），详细手术过程见文献［8-9］。shock+E2组大鼠在液体复苏的同时，一次性皮下注射E2（2 mg/kg）［6］。实验过程依据实验动物伦理学标准，尽量减少人为因素引起的失血和创伤导致的痛苦。

2.2 活体肠系膜淋巴微循环的观察 shock 与shock+E2组大鼠在液体复苏结束后2.5 h、sham 组大鼠在相应时点，应用动态可视化微血管研究系统（Gene＆I型，北京吉安得尔有限公司组装）观察肠系膜淋巴微循环变化。详细过程如下：腹部手术，暴露回盲部肠系膜；将大鼠置于倒置显微镜（Olympus）下，将距回盲部3～5 cm 的肠袢沿腹部手术切口轻拉置于恒温槽中，内含37℃的生理盐溶液（physiological saline solution， PSS； mmol/L： NaCl 0.119，EDTA·Na20.000 03，NaHCO30.025，KCl 0.004 7，葡萄糖 0.005 5，CaCl20.002 5，KH2PO40.001 2，MgSO40.001 17）；随后，用洁净、蘸满温PSS 的棉签将肠系膜轻轻铺平展开，用电子微量泵（2 mL/min）向肠系膜持续滴加37℃的PSS（充氧），以保证肠系膜表面的湿润状态，在40倍水镜下观察、录像。

应用Ipwin32 系统分析肠系膜淋巴微循环的视频，记录ML 的收缩频率（contraction frequency，CF），测量同一ML 的最大收缩口径（end-systolic diameter，ESD）、最大舒张口径（end-diastolic diameter，EDD）及静态口径（static diameter，SD）。计算淋巴管收缩性指数（contractile index，Index I）、总收缩分数（total contractile fraction，Index II）和淋巴管动力学指数（lymphatic dynamic index，LD-Index）。计算公式为：Index I=（EDD2- ESD2）/EDD2；Index II=（EDD2-ESD2）×CF/EDD2；LD-Index=（EDD -ESD）×100CF/SD2。根据CF和3个收缩性指数评估淋巴管收缩性。

3.3 离体ML收缩性与钙瞬变的观察 活体肠系膜淋巴微循环观察结束后，颈椎脱臼执行安乐死，剪取回盲部上部3～5 cm 的一段肠袢，按照我室分离胸导管、制备离体淋巴管环与孵育的方法［10］，用解剖剪及镊子剔除周围多余脂肪组织，制备离体ML 环，固定在细胞收缩/组织张力与离子浓度同步测量系统（Ion-Optix）浴槽中的玻璃管上，维持3 cm水柱的灌注压。

待浴槽内液体温度由4℃自然上升至室温后，加热至37℃，避光加入Fura-2（日本株式会社同仁化学研究所，批号F015）荧光液（1 mg/100 μL 无水二甲基亚砜，5 mmol/L）和F127（日本株式会社同仁化学研究所，批号LU08）溶液（20 mg/100 μL 无水二甲基亚砜）各5 μL，37℃孵育20 min。随后第1次换液，37℃孵育30 min。然后，应用37℃的PSS 换液4 次，彻底洗去荧光物质，保留5 mL 的PSS。再次稳定孵育30 min，当ML出现规律的自发性收缩后，打开荧光探测器，记录ML 的CF、EDD、ESD、［Ca2+］基值和［Ca2+］峰值。观察结束后，更换37℃无钙PSS，20 min 后记录ML 最大被动舒张管径（passive diameters，PD）。计算紧张性指数（tonic index，TI）、收缩幅度（contraction amplitude，CA）和泵流分数（fractional pump flow，FPF），结合CF，评价离体ML 的收缩性。根据记录的［Ca2+］的基值与峰值，计算［Ca2+］差。

4 统计学处理

应用SPSS 17.0进行统计学处理。数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。方差齐性检验后，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用Bonferroni 校正的t检验。P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 雌激素处理对失血性休克大鼠活体肠系膜淋巴微循环的作用

3 组大鼠活体 ML 收缩过程中的 ESD、EDD 和 SD数值见表1，从SD 来看，3 组大鼠所选用的ML 没有显著差异。失血性休克后，大鼠活体ML 的CF、Index II 和LD-Index 显著降低（P＜0.05），E2 处理显著提高了失血性休克大鼠活体ML 的收缩功能（P＜0.05），接近sham组大鼠，见图1。

表1 大鼠活体肠系膜淋巴管的口径Table 1.The mesenteric lymphatic diameters in rats in vivo（μm.Mean±SEM. n=6）

2 雌激素处理对失血性休克大鼠离体ML 收缩性的作用

3 组大鼠离体 ML 收缩过程中的 ESD、EDD 和 PD数值见表2，从PD 来看，3组离体ML没有显著差异。来自shock 组大鼠的离体ML 的CF 和FPF 显著低于来自sham 组大鼠的ML（P＜0.05），E2 处理显著提高了shock 大鼠离体 ML 的 CF 和 FPF（P＜0.05）；3 组大鼠离体ML 的CA 和TI 之间的差异均无统计学显著性（P＞0.05），见图2。

3 雌激素处理对失血性休克大鼠离体ML 收缩过程中LSMCs内外［Ca2+］差的影响

如图3 所示，shock 组大鼠离体ML 收缩过程中LSMCs 内外的［Ca2+］差值显著低于 sham 组（P＜0.05），E2 处理显著提高了 shock 组大鼠离体 ML 收缩过程中LSMCs内外的［Ca2+］差（P＜0.05）。

讨 论

重症失血性休克难治的机制复杂，重症失血性休克的防治依然任重道远［11］。我们基于良好的淋巴微循环功能有利于重症失血性休克向好的方向转归的前期研究基础，结合雌激素具有良好抗休克作用的前人研究工作，观察了E2 治疗对失血性休克淋巴管收缩功能的作用。本研究发现，E2 治疗有效改善了失血性休克大鼠活体和离体ML的收缩性，同时提高了离体ML收缩过程中LSMCs内外的［Ca2+］差。本研究结果为深入研究雌激素改善淋巴管收缩功能的机制、扩展重症失血性休克的治疗新策略提供了一定的实验资料。

针对重症失血性休克的救治策略，美国Alabama大学外科研究中心Chaudry教授指出“人们遭受创伤休克后，会出现水肿；因此如果我们能够将引起水肿的液体引流回血液循环中，那么，我们就能将病人或动物的身体维持在允许性低血压状态，足以维持他们的生命”。可见，寻找促进组织液回流入血的治疗措施，减轻组织水肿，是重症休克防治研究领域的一个新方向。组织液回流入血除了通过微静脉进入血液循环系统外，最主要的途径是经初始淋巴管吸收、形成淋巴液，再经淋巴管系统转运入血。而且，初始淋巴管的不连续内皮较多，内皮细胞间的孔隙较大，可以回吸收大分子蛋白，有助于更多的组织液通过淋巴管系统回流入血。生理状态下，成人每天生成淋巴液约2～4 L，经淋巴管系统回流入血，可见淋巴管系统在体液调节、物质吸收、免疫调节等方面具有重要的作用［12］。

活体淋巴微循环与离体淋巴管收缩性观察的研究发现，淋巴管收缩性及其对血管活性物质去甲肾上腺素［13］、P 物质的反应性下降［10，14］，淋巴流量逐渐减少，淋巴管运输淋巴液的能力下降，淋巴微循环障碍成为休克微循环学说的重要补充。因此，从调控淋巴管收缩性的角度，在一定的时间窗内，通过促进淋巴液回流、减轻组织水肿，对于防治重症休克具有积极的意义。本研究在前期证实雌激素对失血性休克具有良好干预作用的基础上，发现雌激素治疗可有效改善失血性休克大鼠活体、离体淋巴管的收缩功能，提高淋巴管转运淋巴液的能力，这对于通过“自身输液”代偿机制、进而维持失血性休克后的体液平衡具有积极意义。应当指出，本研究克服了ML直径小（100 μm）、壁薄等困难［15］，采用ML 作为离体淋巴管的来源，相对于以前应用的胸导管（400～600 μm）而言，与活体淋巴管收缩性观察更具有一致性。

Figure 1.17β-Estradiol（E2）treatment enhanced the mesenteric lymphatic contractility in vivo in rats after hemorrhagic shock.A：representative images of lymphatic diameter in rats in vivo using dynamic visualization microvascular observation system；B：the lymphatic contraction frequency（CF），contractile index（Index I），total contractile fraction（Index II），and lymphatic dynamics index（LD-Index）in vivo. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.图1 雌激素提高了失血性休克大鼠活体肠系膜淋巴管的收缩性

表2 大鼠离体肠系膜淋巴管的口径Table 2.The isolated rat mesenteric lymphatic diameters（μm.Mean±SEM. n=3）.

Ca2+是血管平滑肌细胞收缩的物质基础，［Ca2+］变化直接影响着血管的舒缩功能［16］；同样，Ca2+也是LSMCs 收缩进而维持淋巴管功能的必备条件，细胞内外［Ca2+］差的变化直接影响着淋巴管的收缩性［7］。为此，本研究首次应用细胞收缩/组织张力与离子浓度同步测量系统，观察了淋巴管收缩过程中LSMCs内外［Ca2+］差的变化，发现淋巴管收缩与LSMCs内外［Ca2+］差具有相关性，雌激素治疗也提高了LSMCs内外［Ca2+］的差值，这对于提高淋巴管收缩功能是有益的。但是，雌激素提高［Ca2+］差的作用是通过提高LSMCs 钙通道功能、还是通过改善能量代谢、亦或通过改善线粒体、内质网等与Ca2+释放相关的细胞器的结构或功能而实现的，还不清楚。同时，最近实验显示，LSMCs 与血管平滑肌细胞表达 ERs［17］相似，亦表达ERα（未发表数据），雌激素是否通过ERα 来发挥对淋巴管收缩功能的调节作用、增加LSMCs 内外［Ca2+］差的作用还需要明确。这些均是今后需要深入研究的方向之一。

Figure 2.17β -Estradiol（E2）treatment enhanced the contractility of mesenteric lymphatics isolated from rats after hemorrhagic shock.A：representative images of isolated lymphatic diameter using vascular tension and ion concentration measurement system（IonOptix BioIon 1.33）at a transmural pressure of 3 cmH2O；B：the isolated lymphatic contraction frequency（CF），contraction amplitude（CA），tension index（TI），and fractional pump flow（FPF）.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.图2 雌激素提高了失血性休克大鼠离体肠系膜淋巴管的收缩性

Figure 3.17β-Estradiol（E2）treatment enhanced the difference between intra- and extracellular［Ca2+］of lymphatic smooth muscle cells（LSMCs）during contraction of mesenteric lymphatics isolated from rats after hemorrhagic shock.A：representative images of isolated lymphatic diameter and difference between intra- and extracellular［Ca2+］of LSMCs using vascular tension and ion concentration measurement system（IonOptix BioIOn 1.33）at a transmural pressure of 3 cmH2O；B：the［Ca2+］changes of LSMCs during isolated lymphatic contraction.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs shock group.图3 雌激素提高了失血性休克大鼠肠系膜淋巴管收缩过程中LSMCs内外［Ca2+］差

综上所述，雌激素明显增强了失血性休克大鼠肠系膜淋巴管的收缩功能，该作用与提高LSMCs 内外［Ca2+］的差值有关。应当指出，本文只是观察了雌激素、失血性休克、肠系膜淋巴管收缩及其与LSMCs内外［Ca2+］差的关系，但详细机制还有待深入研究。