不同类型Monilinia fructicola 菌株的温度适应性及其对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的交互抗性

陈凤平, 郑钰珑, 周 挺, 张 玥, 黄中乔, 刘西莉*,,4

(1. 福建农林大学 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福州 350002；2. 中国烟草总公司福建省公司，福州 350003；3. 中国农业大学 植物病理学系，北京 100193；4. 西北农林科技大学 植物病理学系，陕西 杨凌 712100)

0 引言

褐腐病菌Monilinia fructicola (G. Winter)Honey 是引起果树褐腐病的重要病原菌[1-2]，对果树的花、茎、果实等均可为害，尤其以为害成熟期及储藏期的果实为重。该病原菌可以侵染多种果树，主要包括桃、李、樱桃等核果类果树，以及梨、苹果等仁果类果树。病菌侵染果实后，首先在果实上出现淡褐色斑点，随后迅速扩展产生大量的分生孢子，分生孢子还会引起再侵染造成更大范围的危害，被侵染的果实后期会缩水干燥形成僵果[3]。M. fructicola 主要分布在美洲，是欧洲的检疫性病原，近年来，该病原菌在中国多个桃产区，包括北京、山东、中部、西部及东南地区等均有报道[2,4-6]。对于果树褐腐病，生产中还是以化学防治为主，许多内吸性杀菌剂如苯并咪唑类杀菌剂 (methyl benzimidazole carbamates, MBCs)、甾醇脱甲基抑制剂 (sterol demethylation inhibitors,DMIs)、Qo 位点抑制剂 (quinone outside inhibitors,QoIs) 及琥珀酸脱氢酶抑制剂 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs) 均可有效控制褐腐病的发展[7-10]。

MBCs 类杀菌剂杀菌谱广，具有很好的内吸性，对哺乳动物安全。自20 世纪被开发以来，一直被广泛用于控制植物真菌病害的流行和危害，代表性药剂如多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌灵等。其作用机制是通过与病原菌微管蛋白结合而影响微管的正确组装，从而破坏纺锤丝的形成，最终阻碍病原菌细胞的正常有丝分裂，起到杀菌作用[11-12]，因此该类杀菌剂也称为β-微管蛋白抑制剂。该类药剂对褐腐病有很好的防治效果，然而由于其作用位点单一，长期使用会产生抗药性问题。截至目前，已有多篇文献报道了M. fructicola对MBCs 的抗性，如Ma 等检测到其对苯菌灵和甲基硫菌灵产生了抗性，且引起低抗和高抗的原因是菌株Tub2 基因上的氨基酸发生了变异，分别为H6Y 和E198A 点突变[13]；随后，其他研究者也发现，Monilinia spp. 对苯并咪唑类杀菌剂的抗性相关突变位点为E198A，且该突变位点广泛存在，如在美国加利福尼亚州[14]和南卡罗来纳州[15]，以及巴西[16]、意大利、法国、西班牙和瑞士[17]均有报道。

乙霉威属于氨基甲酸酯类杀菌剂，其对MBCs表现敏感的菌株具有天然不敏感性，但其与多菌灵、甲基硫菌灵等常用的MBCs 具有负交互抗性，因此，生产中乙霉威常作为治理对MBCs 产生抗性菌株的重要杀菌剂。例如：沈宙等研究发现，当多菌灵与乙霉威按质量比1 : 1 混配时，其对多菌灵抗性的番茄灰霉病菌的联合作用系数(共毒系数)达到 460.63[18]；Zhu 等发现，200 μg/mL的多菌灵和乙霉威混剂 (质量比4 : 1)，对抗多菌灵菌株Sclerotinia sclerotiorum 的保护效果达100%，治疗效果为87.1%[19]；Malandrakis 等检测了来自希腊与M. fructicola 同属的M. laxa 菌株对多菌灵的敏感性，发现有37% 的菌株为高抗菌株，多菌灵对该菌株的EC50值大于500 μg/mL，但该菌株对乙霉威却表现敏感[20]。在M. fructicola中也发现多菌灵抗性菌株对乙霉威具有负交互抗性[21]。然而，也有研究者报道，在灰霉病菌中，部分菌株对乙霉威和多菌灵产生了双重抗性[22]。

本研究组在前期研究中发现，对甲基硫菌灵产生抗性的M. fructicola 菌株，在其Tub2 蛋白序列上存在3 个与抗性有关的点突变，包括E198A、E198Q 及F200Y[7]。因此，本研究进一步检测了含不同点突变的M. fructicola 菌株在不同温度下的生长特性，及其对甲基硫菌灵、多菌灵和乙霉威的敏感性差异，明确不同类型菌株的温度适应性及其对乙霉威的交互抗性情况，旨在为进一步监测褐腐病菌对MBCs 类杀菌剂的抗性发生发展提供理论基础，为利用乙霉威治理MBCs 抗性菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试药剂与培养基

杀菌剂：98.5% 甲基硫菌灵 (thiophanatemethyl) 原药、98.0%多菌灵 (carbendazim) 原药及99.1%乙霉威 (diethofencarb) 原药，均由沈阳化工研究院合成。甲基硫菌灵与乙霉威用丙酮溶解，而多菌灵溶解于0.2 mol/L 的盐酸中，均配制成1 × 104μg/mL 的母液，于 4 ℃ 冰箱中贮存，备用。

PDA 培养基：200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖，20 g 琼脂粉，用去离子水定容至1 L。于121 ℃，高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 供试菌株

4 种类型M. fructicola 菌株均源自中国农业大学种子病理药理实验室保存库，分别为对甲基硫菌灵表现敏感的菌株3 株；对甲基硫菌灵表现为抗性且在β-微管蛋白上分别携带E198A、E198Q及F200Y 点突变的菌株各3 株 (表1)[7]。上述菌株分别用S、R(E198A)、R(E198Q)及R(F200Y)表示。

1.3 试验方法

1.3.1 温度对不同类型菌株生长的影响 选取在PDA 平板上培养5 d 的新鲜菌落，在菌落边缘同一圆周上打取5 mm 菌饼，接种于PDA 平板上，每皿接种1 个菌饼，每菌株3 次重复。分别置于13、18、25、28 及33 ℃培养箱中，黑暗培养5 d，测量各温度培养箱下各菌株的菌落直径，并利用公式 (1)[23]分析菌落直径与温度的关系，计算不同类型菌株的最适生长温度。同时根据公式 (2) 计算各菌株的生长速率，并求出每类菌株的平均生长速率。

式 (1) 中：DT为菌落直径，T 为温度，a、b 和 c 为常数。

式 (2) 中：Gr为生长速率，DT和t 分别表示T 温度培养下的菌落直径和培养时间。

1.3.2 甲基硫菌灵对不同类型菌株生长的影响配制甲基硫菌灵的系列质量浓度药液，将其分别加入冷却至约45 ℃的PDA 培养基中，制成终浓度分别为 0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含药平板，并以含等量丙酮的PDA 平板为对照。在预培养的各菌株菌落边缘打取直径5 mm 的菌饼，接种于以上平板中央，置于23 ℃培养箱中黑暗培养，每处理3 次重复。当对照菌落直径达到培养皿直径的80%左右时，采用十字交叉法测量菌落直径，按照公式 (3)[24-25]求出菌株在各甲基硫菌灵浓度处理下的相对生长量 (%)。

表1 不同点突变菌株对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的交互抗性Table 1 Cross resistance between methyl-benzimidazole carbamates and diethofencarb in Monilinia fructicola isolates with different mutations in β-tubulin gene

式 (3) 中：RGi为i 处理的相对生长量，Di和D0分别表示i 处理和对照的平均菌落直径。

2．5 慢性病相关知识来源情况 被调查小学生最信任和最喜欢的健康知识来源分别是老师讲课和电视，饮食和运动习惯受家人影响的比例最高。见表5。

1.3.3 多菌灵对不同类型菌株生长的影响 配制多菌灵系列质量浓度药液，将其分别加入冷却至约45 ℃的PDA 培养基中，制成终浓度分别为0.01、0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含药平板。以不含药PDA 平板为空白对照，并接菌于平板上，每处理3 次重复。于23 ℃黑暗培养5 d 后，由公式 (3)求出菌株在各多菌灵浓度处理下的相对生长量 (%)。

1.3.4 乙霉威对不同类型菌株生长的影响 配制乙霉威系列质量浓度药液，将其分别加入冷却至约45 ℃的PDA 培养基中，制成终浓度分别为0.1、1、5 及 50 μg/mL 的含药平板，以不含药PDA 平板为对照，并接菌于平板上，每处理3 次重复。于23 ℃黑暗培养5 d 后，由公式 (3) 求出菌株在各乙霉威浓度处理下的相对生长量 (%)。

1.3.5 交互抗药性测定及分析 根据1.3.2～1.3.4 节的试验结果，分别选择甲基硫菌灵、多菌灵和乙霉威的区分浓度。分别配制终浓度为1 μg/mL 的甲基硫菌灵、多菌灵和乙霉威含药PDA 平板，同时设置两种对照处理，甲基硫菌灵和乙霉威处理的对照为含0.1%丙酮的PDA 平板处理，多菌灵处理的对照为不含丙酮的PDA 平板处理，每处理重复3 次。选取5 mm 菌饼接菌于各平板中央，23 ℃黑暗培养5 d，以十字交叉法测定各菌株的菌落直径，并计算菌株在每个处理下的平均菌落直径，用公式 (3) 计算菌株的相对生长量。以对乙霉威的相对生长量为纵坐标，对甲基硫菌灵或多菌灵的相对生长量为横坐标，用公式 (4)[26]分别分析 S 型菌株与R(E198A)、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株对两种药剂的相对生长量的相关性，计算相关系数r 值及p 值，并根据r 值、p 值和表型判断交互抗性情况。当 p 值 ＜ 0.05、r 值 ＜ 0，且对甲基硫菌灵或多菌灵抗性的菌株对乙霉威表现敏感时，则判定该类型菌株对乙霉威存在负交互抗性；当p 值 ＞ 0.05，无论r 值大小和表型如何，则判定该类型菌株对两种药剂均不存在交互抗性。

式 (4) 中：y 为对乙霉威的相对生长量，x 为对甲基硫菌灵或多菌灵的相对生长量，a 和b 为常数。

2 结果与分析

2.1 不同类型菌株对温度适应性

分别于13、18、25、28 及33 ℃下培养4 种类型菌株。结果表明，所有菌株均可以在13～28 ℃之间生长，但均不能在33 ℃下生长；所有菌株均表现为在一定温度范围内随温度的升高，菌落生长加快，但当温度达到一定高度后，又随温度的升高，菌落生长减慢。进一步分析菌落生长与培养温度的关系发现，4 种类型菌株对温度的生长曲线模式相同，均呈现为显著的二阶多项式相关 (图 1A～1D，p 值均 ＜ 0.05)；但最适生长温度具有一定的差异，敏感菌株与R(E198A)型抗性菌株的最适生长温度相同且最高，均为22.7 ℃(图1A～1B)，R(F200Y)型抗性菌株的最适生长温度次之，为22.1 ℃(图1C)，而R(E198Q)型菌株的最适生长温度最小，为22.0 ℃(图1D)。

2.2 不同类型菌株的生长速率差异

分析4 种类型菌株分别在13、18、25 及28 ℃下生长速率的差异。结果 (图2A～2D)表明，其生长速率范围分别为 0.11～0.23 cm/d、0.25～0.36 cm/d、0.46～0.69 cm/d 及 0.03～0.60 cm/d；其中，S、R(E198A)及R(F200Y)型菌株在所有温度条件下的生长速率均无显著差异，而R(E198Q)型菌株生长速率均表现为最慢，且在13 ℃和28 ℃条件下显著低于其他3 类菌株。

2.3 甲基硫菌灵对不同类型菌株生长的影响

2.4 多菌灵对不同类型菌株生长的影响

当多菌灵的处理质量浓度为0.01 μg/mL 时，所有菌株的相对生长量均大于95%。当其质量浓度为0.1 μg/mL 时，S 型菌株的平均相对生长量仅为8.5%，其他3 类抗性菌株的相对生长量均大于98.0%，3 类抗性菌株的相对生长量显著高于S 型菌株，但抗性菌株间无显著差异 (图4A)。当处理质量浓度提高到1.0 μg/mL 时，S 型菌株的平均相对生长量仅为3.0%，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相对生长量仍大于100.0%，但 R(E198Q)型菌株的相对生长量降低到45.8%，且显著低于其他两类抗性菌株 (图4B)。当处理质量浓度提高到5.0 μg/mL时，S 型菌株和R(E198Q)型菌株停止生长，R(E198A)和R(F200Y)型抗性菌株相对生长量仍大于80.0%，但R(F200Y)型菌株显著低于R(E198A)型菌株 (图4C)。随着处理浓度进一步提高到50.0 μg/mL 时，除了R(E198A)型菌株，其他3 类菌株均停止生长 (图4D)。综合表明，S 型菌株对多菌灵表现敏感；R(E198A)、R(E198Q)和 R(F200Y)3 种类型菌株均对多菌灵表现抗性，但抗性有所差异，其中R(E198Q)型抗性水平相对较低，R(F200Y)型次之，R(E198A)型抗性水平最高。

2.5 乙霉威对不同类型菌株生长的影响

当乙霉威的处理质量浓度为0.1 μg/mL 时，S 型菌株的平均相对生长量最高，为98.8%，其他3 类抗性菌株的相对生长量范围为59.9%～94.8%，3 类抗性菌株中R(E198Q)型的相对生长量显著低于其他两类 (图5A)。当处理质量浓度提高到1.0 μg/mL 时，R(E198A)型抗性菌株的平均相对生长量仅为0.2%；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相对生长量范围为87.3%～96.2%，且三者之间无显著差异 (图5B)。当处理质量浓度提高到5.0 μg/mL时，R(E198A)型菌株停止生长；S 型、R(E198Q)和R(F200Y)型菌株相对生长量范围为92.7%～101.7%，且三者之间无显著差异 (图5C)。随着处理浓度进一步提高到50.0 μg/mL 时，除了R(E198A)型菌株，其他3 类菌株依然可以生长，且R(F200Y)型和S 型无显著差异，但显著高于R(E198Q)型 (图5D)。综合表明，R(E198A)型菌株对乙霉威表现敏感，S 型菌株表现为天然不敏感，R(E198Q)和 R(F200Y)两种类型则表现为抗药性，且抗性水平差别不大。

2.6 MBCs 与乙霉威的交互抗性

综合2.3～2.5 节的分析结果可见，当甲基硫菌灵和多菌灵的处理质量浓度达1.0 μg/mL 时，可以明显区分S 型和其他3 类菌株。因此，选择质量浓度为1.0 μg/mL 时的相对生长量分析其与乙霉威的交互抗性情况。如表1 所示，3 株S 型菌株对甲基硫菌灵的相对生长量均小于2.0%，但对乙霉威的相对生长量均大于80.0%，表明这3 个菌株对乙霉威均表现为天然不敏感性；3 株R(E198A)型菌株对甲基硫菌灵的相对生长量均大于94.0%，但其对乙霉威的相对生长量均小于1.0%，表明这3 株菌株对乙霉威均表现敏感；而R(E198Q)型和R(F200Y)型菌株，对甲基硫菌灵和乙霉威的相对生长量均大于84.0%，表明这些菌株对乙霉威表现抗性 (表1)。相关性分析结果表明，S 和R(E198A)型组合菌株对甲基硫菌灵的敏感性与乙霉威存在显著负相关性 (图 6A，r =−0.992，p = 0.000)；S 分别和R(E198Q)型和R(F200Y)型组合菌株对甲基硫菌灵的敏感性与乙霉威具有一定的正相关性，但相关性不显著 (图 6B～6C，p 均 ＞ 0.050)。分析多菌灵与乙霉威的交互抗药性，发现不同类型组合菌株的表现结果与甲基硫菌灵一致 (表1，图6D～6F)。

综合以上研究结果，说明β-微管蛋白上不同点突变的菌株对MBCs 和乙霉威的交互抗药性结果不同，只有198 位从谷氨酸变成丙氨酸 (E198A)时，MBCs 与乙霉威之间才存在负交互抗性；而其他两种突变如当198 位从谷氨酸变成谷氨酰胺(E198Q) 或200 位从苯丙氨酸变成酪氨酸 (F200Y)时，MBCs 与乙霉威均不存在负交互抗性。

3 结论与讨论

本课题组前期研究发现，M. fructicola 菌株对甲基硫菌灵的抗性与Tub2 蛋白上的3 种点突变有关，即E198A、E198Q 和F200Y，且每一株抗性菌株在Tub2 蛋白上只含有其中一种突变位点[7]。已有研究表明，该3 种突变菌株在22 ℃环境中，其生长速率与敏感菌株均无差异[7]。而本研究结果表明，3 种突变菌株的生长速率与温度有一定关系，其中R(E198A)和R(F200Y)型菌株在4 种温度下的生长速率与敏感菌株之间均无差异；但R(E198Q)型菌株在不同温度下表现不同，在低温 (13 ℃) 和高温 (28 ℃) 时，其生长速率显著低于其他3 类菌株，推测R(E198Q)型菌株在逆境中的竞争力弱于其他抗性菌株及敏感菌株，该特性可能是R(E198Q)型菌株在田间很少被发现和报道的原因之一。

甲基硫菌灵和多菌灵是MBCs 的典型代表药剂，其对病原菌的抑制活性存在一定差异，然而在生产实践中，通常使用共同的区分浓度即50 μg/mL 作为 M. fructicola 抗性检测的区分浓度[15,17]。本研究发现，在M. fructicola 中，抗MBCs的不同类型菌株对甲基硫菌灵和多菌灵的敏感性也存在一定差异。例如，在5 μg/mL 甲基硫菌灵处理中，R(E198Q)型菌株可以生长，但同样浓度的多菌灵处理则可以完全抑制R(E198Q)型菌株的生长。研究者经常采用较高的区分浓度进行病原菌的抗药性检测，这可能导致R(E198Q)型菌株很少被报道。因此，为避免某些抗性菌株在研究中被漏检，测定不同MBCs 时最好采用不同的区分浓度。针对M. fructicola 菌株对多菌灵的抗性检测，其区分浓度建议降低为1 μg/mL，而对甲基硫菌灵进行抗性检测的区分浓度可以是1 μg/mL 或5 μg/mL。

乙霉威通常被作为MBCs 类药剂的抗性治理药剂，然而本研究发现，不同Tub2 突变位点引起的抗MBCs 菌株对乙霉威的敏感性不同。乙霉威和MBCs 的负交互抗性与M. fructicola 的Tub2 基因变异情况有关，只有Tub2 蛋白在198 位发生突变并且由谷氨酸突变为丙氨酸 (E198A) 时，该抗性菌株对乙霉威才表现为敏感；其他由E198Q 或F200Y 突变引起的抗MBCs 菌株，对乙霉威依然保持抗性状态；说明乙霉威和MBCs的负交互抗性并不是存在于所有的抗MBCs 菌株中，因此，在生产中利用乙霉威治理M. fructicola对MBCs 的抗性时，首先需鉴定从相关区域分离获得的抗性菌株的突变类型。Chen 等在研究M. fructicola 对多菌灵和乙霉威的敏感性时发现，所有抗多菌灵菌株对乙霉威均表现敏感，进一步分析发现，抗性菌株的Tub2 蛋白均携带E198A 突变[21]。该研究结果也可以为其他研究提供借鉴，例如在灰霉病菌抗药性相关研究中，刘圣明等发现大量菌株对多菌灵和乙霉威均表现抗性，抗性频率分别达到81.29%和93.53%，这可能与大部分抗多菌灵菌株未发生E198A 突变有关[22]。

综上所述，在M. fructicola 对MBCs 产生抗性的3 类菌株中，R(E198Q)型菌株在温度逆境中的生长速率低于其他两类抗性菌株及敏感菌株；不同类型抗性菌株对不同MBCs 药剂的敏感性有所差异，因此，使用区分浓度检测抗性菌株时对于不同药剂需有所不同；不同类型抗性菌株对乙霉威的交互抗性不同，乙霉威与多菌灵的负交互抗性现象仅存在于R(E198A)型菌株中。本研究结果可为未来监测M. fructicola 对MBCs 类药剂的抗性发生发展情况以及制定有效的抗性治理策略提供理论支持，为有效控制褐腐病的流行和危害提供理论参考。