miR-124a和miR-449a对非小细胞肺癌的诊断价值

彭焦武，孙承谋

（1.枝江市人民医院检验科，湖北 枝江 443200；2.宜昌市夷陵医院检验科，湖北 宜昌 443100）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的70%～85%，虽然近年来在肺癌的诊断和治疗方面取得了一定的进展，但肺癌预后仍然较差，5年总生存率（overall survival，OS）＜15%[1]。缺乏早期筛查和诊断NSCLC的有效生物标志物是大多数NSCLC患者被诊断时已处于晚期的原因，这直接导致了此类癌症患者的高死亡率[2]。因此，临床迫切需要寻找用于早期诊断NSCLC的新的生物标志物。有研究结果显示，微小RNA（microRNA，miRNA）在各种类型的癌症中异常表达，并作为癌基因或抑癌基因来调节肿瘤的生物学过程，如肿瘤发生、分化、增殖、凋亡、肿瘤侵袭和转移[3]。特定miRNA的失调也可用于预测各类肿瘤患者的预后[4]。同时，由于miRNA足够稳定，可在血清中被检测到，因此可作为早期诊断肿瘤和判断预后的潜在非侵入性生物标志物。有研究结果显示，血清miRNA可以作为直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等的诊断或预后生物标志物，在这些异常表达的miRNA中，有4种miRNA[微小RNA-124a（microRNA-124a，miR-124a）、微小RNA-449a（microRNA-449a，miR-449a）、微小RNA-146（microRNA-146，miR-146）、微小RNA-106a（microRNA-106a，miR-106a）]与肿瘤相关的生物学过程有关[5]。miR-124a在肿瘤组织中表达下调，其过表达可以抑制肿瘤细胞的迁移和增殖，并促进细胞凋亡[6]。此外，miR-449a是与肿瘤进展有关的致癌基因或抑癌基因[7]。目前，关于NSCLC患者血清miR-124a和miR-449a表达的研究较少。因此，本研究拟通过检测NSCLC血清miR-124a和miR-449a水平，探讨miR-124a、miR-449a与NSCLC的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年1月—2016年12月枝江市人民医院行手术切除肿瘤的原发性NSCLC患者90例（NSCLC组），其中男62例、女28例，年龄（67.89±8.16）岁。所有患者均随访36个月，根据术后复发情况分为复发组56例（男39例，女17例）和未复发组34例（男23例，女11例）。选择同期枝江市人民医院确诊的肺部良性结节患者60例（良性结节组），其中男37例、女23例，年龄（66.92±12.54）岁。选择同期枝江市人民医院健康体检者80名（正常对照组），其中男52名、女28名，年龄（66.18±10.28）岁。本研究经枝江市人民医院医学伦理学委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）经组织病理学或细胞学明确诊断，符合《原发性肺癌诊疗规范（2015年版）》[8]；（2）有完整的临床病历或体检资料，无其他遗传病；（3）入组前未进行过治疗或药物干预；（4）治疗期间无死亡，均出院随访。

1.2.2 排除标准 （1）患心血管疾病者，合并严重肝、肾功能不全者，存在第二原发肿瘤者；（2）近3个月内服用过抗菌药物者；（3）合并其他结缔组织疾病、内分泌和代谢性疾病者；（4）有精神病史或精神病家族史者。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集及样本采集 收集所有对象的基本资料，计算体质量指数（body mass index，BMI）。采集所有对象空腹静脉血6 mL，分成2管，一管加入1 mL TRIzol试剂（北京索来宝科技有限公司，批号：15596-026）后-80 ℃保存备用；另一管以700×g离心10 min，分离血清。

1.3.2 血红蛋白（hemoglobin，Hb）和神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）检测 采用BC5390全自动血液分析仪（深圳迈瑞公司）及配套试剂检测Hb。采用cobas e601电化学发光免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂测定血清NSE水平。

1.3.3 miR-124a和miR-449a检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测血清miR-124a和miR-449a水平。取出加入TRIzol试剂的血液样本，室温下放置10 min，待完全溶解后加入600 μL氯仿，混匀直至溶液乳化为乳白色，静置5 min，4 ℃、12 000×g离心15 min，将顶部的无色上清液小心吸取到离心管中，加入等体积异丙醇，12 000×g离心10 min，然后加入75%乙醇1 mL洗涤沉淀物，获得总RNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳测试RNA的完整性。选择合格的RNA样本进行互补DNA（complementary DNA，cDNA）合成。根据Taq Man microRNA逆转录试剂盒（美国ABI公司）说明书，在37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min条件下合成cDNA。根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量PCR试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]说明书进行PCR扩增，扩增条件：95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40个循环。检测仪器为ABI 7500 PCR仪（美国ABI公司）。miR-124a引物序列：上游引物 5'-GGTAAGGCACGCGGT-3'，下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-449a引物序列：上游引物5'-TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT-3'，下游引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；内参U6引物序列：上游引物5'-CTGGTTAGTACTTGGACGG-GAGAC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。采用2-ΔΔCt法计算miR-124a和miR-449a的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析评估miR-124a、miR-449a与NSE的相关性。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估NSE、miR-124a和miR-449a诊断NSCLC的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组、良性结节组和正常对照组一般资料及miR-124a、miR-449a水平的比较

NSCLC组血清NSE水平高于正常对照组和良性结节组（P＜0.05），血清miR-124a和miR-449a水平低于正常对照组和良性结节组（P＜0.05）。正常对照组与良性结节组之间血清NSE、miR-124a和miR-449a水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。3组之间年龄、性别、BMI、吸烟史和Hb差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 NSCLC组、良性结节组和正常对照组一般资料及血清miR-124a、miR-449a水平的比较

2.2 NSCLC患者未复发组和复发组一般资料及miR-124a、miR-449a水平的比较

与未复发组比较，复发组血清NSE水平升高（P＜0.05），血清miR-124a和miR-449a水平降低（P＜0.05）。2个组之间年龄、性别、BMI、吸烟史、肿瘤直径、病理类型和TNM分期差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 NSCLC患者miR-124a、miR-449a及NSE的相关性

miR-124a与miR-449a呈正相关（r=0.441，P＜0.05），miR-124a、miR-449a与NSE均呈负相关（r值分别为-0.377、-0.528，P＜0.05）。

表2 未复发组和复发组一般资料及miR-124a、miR-449a水平的比较

2.4 NSE、miR-124a和miR-449a单项及联合检测诊断NSCLC的效能

ROC曲线分析结果显示，NSE、miR-124a和miR-449a单项诊断NSCLC的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.660、0.703、0.759。在3项指标组合检测中，NSE+miR-124a+miR-449a联合检测诊断NSCLC的AUC（0.895）和敏感性（96.25%）均最高，miR-124a+miR-449a联合检测诊断NSCLC的特异性最高（90.31%）。见表3、图1。

表3 NSE、miR-124a和miR-449a单项及联合检测诊断NSCLC的ROC曲线参数

图1 NSE、miR-124a及miR-449a单项及联合检测诊断NSCLC的ROC曲线

3 讨论

目前，临床一般依据病理检查结果对NSCLC进行诊断和预后评估[9]。但病理检查属于侵入式检查方法，通常需要通过肺穿刺、活检或支气管镜获得组织或细胞，操作不便，且有创伤，故不易被患者接受[10]。因此，临床需要一种用于NSCLC早期诊断和预后评估的无创、易于使用且准确度较高的生物标志物。miRNA通常被定义为调控分子，miRNA的异常表达与各种类型的肿瘤有关[11]。目前已发现miRNA在包括血清、尿液和唾液在内的体液中稳定表达，因此miRNA有望成为可用于肿瘤诊断、预后判断或治疗监测的指标[12]。然而，大多数研究关注于组织样本中miRNA水平的变化，只有少数研究探讨了血清miRNA作为生物标志物的实用性[13]。因此，本研究探讨了miRNA在NSCLC诊断中的潜在价值。

miR-124a和miR-449a在肺癌的发生、发展中都有重要的作用。有研究结果显示，miR-124a对T细胞的增殖、分化和生长具有重要的调控作用[14]。miR-449a可引起信号转导并抑制信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），从而降低受体细胞的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，这间接抑制了人支气管上皮样细胞的恶性转化[15]。乳腺癌、B细胞淋巴瘤、肺癌和结肠癌等多种实体恶性肿瘤中miR-124a和miR-449a表达降低[16]。此外，miR-124a和miR-449a表达升高可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[17]。本研究结果显示，正常对照组和良性结节组血清miR-124a和miR-449a水平变化不显著，但NSCLC组血清miR-124a和miR-449a水平显著下降，且复发的NSCLC患者血清miR-124a、miR-449a水平低于未复发的NSCLC患者。

有些血清标志物，如NSE、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等已被广泛用于NSCLC的诊断、预后评估、疗效监测[18-19]。本研究比较了miR-124a、miR-449a与NSE诊断NSCLC的效能。ROC曲线分析结果显示，miR-124a、miR-449a和NSE诊断NSCLC的AUC分别为0.703、0.759和0.660，敏感性分别为81.46%、72.16%、82.61%，特异性分别为55.37%、73.26%、44.72%。miR-124a和miR-449a的诊断效能优于NSE，这提示血清miR-124a和miR-449a或可作为诊断NSCLC的生物标志物。由于miR-124a、miR-449a诊断NSCLC的特异性较低。因此，本研究比较了miR-124a、miR-449a和NSE不同组合诊断NSCLC的效能，结果显示NSE+miR-124a+miR-449a联合检测诊断NSCLC的AUC（0.895）和敏感性（96.25%）均最高，miR-124a+miR-449a联合检测的特异性最高（90.31%）。

综上所述，NSCLC患者血清miR-124a和miR-449a水平降低，NSCLC复发患者更低，因此miR-124a和miR-449a或可作为辅助诊断NSCLC的血清学标志物。但本研究为横断面研究，得出的结论尚需进一步验证。