饲料中色氨酸测定方法研究进展

宋 洁，王丽芳，姚一萍，史 培，张三粉，钟华晨，郭晨阳

［1. 农业农村部农产品质量安全风险评估实验室 （呼和浩特） 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特010031；2. 内蒙古自治区动物营养与饲料科学重点实验室 内蒙古农业大学动物科学学院， 内蒙古 呼和浩特010018］

图1 色氨酸结构式

色氨酸（tryptophan，Trp）是一种功能性必需氨基酸，化学名称为α-氨基-β-吲哚丙酸，结构式见图1，分子构型有D 型、L 型和DL 型3 种同分异构体，天然存在且易被动物体代谢吸收的为L 型［1-2］。L-色氨酸与赖氨酸、 蛋氨酸并称为三大氨基酸饲料添加剂，是5-羟色胺、褪黑素、烟酸、辅酶等典型生理活性物质的生化前体， 具有促进动物生长发育、提高免疫力、减缓氧化应激、改善肉品质等作用［3-5］。 色氨酸缺乏将可能导致动物出现采食量下降、体重减轻、神经功能障碍等一系列问题［6］。由于动物自身不能合成色氨酸， 必须从饲料中摄取，饲料中色氨酸含量的准确测定，对于动物体内色氨酸平衡及机体健康至关重要［7-8］。 目前，饲料中色氨酸的测定方法正在不断发展与完善， 前处理方法主要有常规水解法及微波快速水解法［9-10］，仪器测定主要有光谱法（包括紫外或荧光分光光度计法、近红外法等）、色谱法（包括氨基酸分析仪法、高效液相色谱法、气质联用、毛细管电泳等方法）［11-12］。 多种分析方法的结合使色氨酸分析的灵敏度、精确度以及自动化程度有了很大提高。该文对目前常用饲料中色氨酸主要分析方法进行综述， 对于饲料营养品质评定工作具有十分重要的参考价值。

1 前处理方法

水解是色氨酸含量分析的关键步骤， 水解质量的好坏直接影响分析结果的准确性［13］。 色氨酸在酸性条件下易分解， 无法通过酸水解与其他氨基酸同步测出含量，必须单独测定［14］。 目前，饲料中色氨酸的测定前处理主要通过常规碱水解，耗时过长，容易影响色氨酸分析结果的准确性，通过提高水解温度， 减少水解时间等条件的优化能有效解决以上问题［15］。 近年来，微波技术因反应快、能耗低、易操作等优势日益受到关注。微波水解是样品及水解液极性分子在超高频电磁波作用下随微波频率快速变换取向，分子在来回转动过程中与周围分子高速碰撞摩擦，增加总能量，在密闭环境中快速加热水解，但氨基酸的化学形式不变［16-17］。采用微波碱水解法水解样品， 不但可以克服常规水解的缺点， 而且易于控制碱水解条件， 具有安全、省时、操作简便等优点，适用于大规模饲料样品中色氨酸的高效、准确测定。

2 光谱仪法

2.1 荧光分光光度法

色氨酸属于芳香族氨基酸， 侧链具有生色基团，能在280 nm 激发光作用下在不同电子能级之间跃迁产生内源性荧光信号，利用荧光分光光度计可测定色氨酸含量［18］。饲料蛋白中除色氨酸外，通常还含有酪氨酸、 苯丙氨酸等能产生天然荧光的氨基酸，其激发光谱和发射光谱相互重叠，采用常规的荧光分析方法很难准确区分，因此，需要将荧光分光光度法与化学计量学方法相结合实现色氨酸定量分析［19］，利用导数技术可解决光谱重叠问题［20］。

《实验动物配合饲料氨基酸的测定》（GB/T 14924.10—2008） 采用荧光分光光度法测定实验动物配合饲料中色氨酸的含量，饲料原料经过碱水解后，在pH 值为11 的条件下，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100 倍，且荧光峰相差40 nm 以上，根据这一特点实现色氨酸的定量分析［21］。 张悦等［22］将同步荧光分析技术与一阶导数光谱技术结合，实现了重叠荧光光谱很好的分离效果， 色氨酸的同步特征峰略受酪氨酸弱峰影响， 通过一阶导数处理使色氨酸和酪氨酸混合液与色氨酸的一阶导数同步荧光光谱在290 nm 波长处重叠，结合峰零法消除酪氨酸干扰，可以准确测定色氨酸含量。王怀友等［20］研究表明，在pH 值为7.4 的条件下，用221 nm 作为激发波长， 采用二阶导数荧光光度法能很好地分离色氨酸和酪氨酸，避免光谱重叠。色氨酸在318 nm 处，酪氨酸在283 nm 处，二阶导数峰高与浓度呈线性关系，实现同步测定。

2.2 紫外分光光度法

紫外分光光度法能够对化合物进行定量分析， 测定190～800 nm 波长范围内样品吸光度值。色氨酸结构中含有苯环共轭双键结构， 不需添加其他发色试剂， 在紫外区可直接定量， 色氨酸在278 nm 处有最强吸收， 在0.006～0.200 mmol/L 浓度范围有良好线性［19］。 但由于苯丙氨酸和酪氨酸等其他带苯环氨基酸干扰色氨酸检测结果， 需要进行衍生化反应生成具有紫外吸收的化合物，之后采用紫外分光光度计测定色氨酸含量［11］。

《饲料中色氨酸的测定》（GB/T 15400—2018）采用分光光度法测定饲料中色氨酸的含量， 饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离氨基酸，在硫酸介质中、氧化剂亚硝酸钠存在条件下，色氨酸C11位的氨基与对二甲氨基苯甲醛发生缩合反应生成蓝色化合物， 其吸光度在一定范围内与色氨酸含量成正比， 在590 nm 波长处有最大吸收，且不受其他氨基酸的干扰［23］。 张婷婷等［24］建立了可见光分光光度法快速、 准确地检测种子发酵液中L-色氨酸含量的方法。 实验以对二甲氨基苯甲醛（PDAB）为显色剂，显色反应的温度和时间定为60 ℃水浴20 min，于590 nm 波长检测。 该方法在20～80 μg/mL 范围内线性良好，R2=0.999 34， 且不受其他氨基酸的干扰， 样品平均回收率为101.5%，RSD=1.08%。 经过与高效液相色谱（HPLC）方法对比，该方法精密度与HPLC 法检测的结果基本一致，误差在2%以内，显色稳定，结果准确且不受其他氨基干扰，适合L-色氨酸含量的快速检测。

2.3 近红外光谱仪技术

近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）技术具有测定速度快、成本低等优势，广泛应用于饲料样品水分、蛋白质、氨基酸等指标的快速定量测定［25］。 其原理是利用近红外光照射到有机物质的含氢基团（C-H、N-H、O-H、S-H 等），使其在可见区和中红外区之间 （波长780～2 500 nm 区域）跃迁时产生明显光谱变化， 借助化学计量学建立化学值与近红外光谱的吸光度或光密度值之间的校正模型， 利用校正模型代替常规化学方法对未知样品进行预测， 实现样品中多种成分含量的测定［26-27］。

湖南省地方标准《饲料中氨基酸的测定 近红外法》（DB 43/T 1065—2015）中利用氨基酸中的含氢化学键在近红外区具有特定的倍频和合频吸收带，获得其在近红外区的吸收光谱，通过主成分分析、偏最小二乘法等化学计量学手段，建立饲料样品近红外光谱测定氨基酸含量的线性或非线性模型， 从而实现利用饲料样品的近红外光谱信息快速测定氨基酸含量。 张斌等［28］运用近红外谷物分析仪在波长1 100～2 498 nm， 对饲料样品进行近红外光谱扫描， 发现运用改良的偏最小二乘法的全局定标方法和局部飞速定标方法预测色氨酸含量效果最好，方程预测标准误差低，外部验证结果准确，可用于色氨酸定量分析。 Fontaine 等［29］开发了近红外反射光谱（NIRS）校准方法，可以准确快速地预测大豆、菜籽粕、葵花籽粕、豌豆、鱼粉等1 000 多种饲料原料中包括色氨酸在内的多种必需氨基酸含量， 并给出了详细的数据和图形以表征获得的校准方程式。 NIRS 预测与参考结果相比非常吻合，相对平均偏差低于5%。NIRS 可以提高饲料配方的精准度，从而提高混合饲料的质量。

3 色谱仪法

3.1 液相色谱仪

3.1.1 氨基酸自动分析仪 氨基酸自动分析仪利用经典的茚三酮柱后衍生法来定量分析水解蛋白中的氨基酸。 其分离柱采用Na+型（或Li+型）磺酸基强酸型阳离子交换树脂， 与每种氨基酸有不同反应，不同的氨基酸有不同的分离时间。样品中的氨基酸吸附在分离柱的树脂上， 因缓冲液的pH值、离子强度、分离柱温度不同而使各种氨基酸得以分离，在微酸性的热溶液中，茚三酮与色氨酸发生氧化、脱氨和脱羧作用，生成的氨基与茚三酮、还原茚三酮作用生成可以被分光光度计检测的紫色化合物，在570 nm 处有最大吸收，颜色深浅与色氨酸含量成正比， 对比标准样品即可对未知样品中的色氨酸进行定性定量检测［19］。 该仪器具有自动化程度高、重现性好、结果可靠等多项优点，且由于阳离子交换柱对氨基酸进行了分离纯化，避免了其他物质对色氨酸衍生化的干扰， 适用于大量样品的分析［30］。

《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246—2000）采用常规碱水解， 即饲料中的蛋白质在110 ℃烘箱、4 mol/L LiOH 作用下水解20 h， 水解出的色氨酸再用氨基酸自动分析仪分离测定［31］。 陈向群等［15］采用4 mol/L LiOH、145 ℃、水解5 h 快速水解法联合氨基酸自动分析仪测定羽毛粉中色氨酸含量，方法回收率91%，变异系数2.24%，能缩短分析时间且不影响分析结果的准确度， 与常规碱水解法所测结果基本一致。 周虹等［14］建立了用微波碱水解样品快速测定浓缩料等农产品中色氨酸的方法，通过筛选微波碱水解的最优条件，确定样品粒度为60 目，称样量20 mg，碱解剂为5 mol/L 氢氧化钠溶液， 设置微波水解仪水解温度90 ℃，水解时间90 min，并用氨基酸自动分析仪Na+离子流动相系统，150 mm×4.6 mm 色谱柱，57～74 ℃梯度洗脱检测色氨酸含量， 方法回收率97.2%～101.2%，样品RSD＜10.2%，结果准确、高效、重现性好，优于常规碱水解。

3.1.2 高效液相色谱仪 高效液相色谱法包括正相高效液相色谱法（HPLC）和反相高效液相色谱法（RPLC）。 正相高效液相色谱法中流动相的极性小于固定相的极性。 反相高效液相色谱法中流动相的极性大于固定相的极性。 柱前衍生正相高效液相色谱法的原理是先用衍生试剂将氨基酸转化为具有可见光、 紫外生色团或者能产生荧光的衍生物， 再通过紫外、 荧光等检测器测定氨基酸含量，其优点是衍生条件可以任意选定、衍生化副产物干扰减少、生化反应溶剂不用匹配流动相、衍生反应完全。 柱前衍生反相高效液相色谱是反相键合高效液相色谱 （RPLC） 和柱前衍生技术的结合［32］。这两种方法的关键都在于衍生剂的选择，衍生剂需具备稳定性强、结合性好、衍生反应条件温和、毒副作用小等优点。常用的衍生剂有邻苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、9-氯甲酸芴甲酯（FMOC）、异硫氰酸苯酯（PITC）和6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐（AQC）等［33］。

《饲料中色氨酸的测定》（GB/T 15400—2018）建立了饲料中色氨酸含量测定的高效液相色谱法。在流动相为乙酸钠缓冲液和甲醇、色谱柱柱温为室温、检测波长280 nm 等色谱条件下，饲料中的色氨酸与杂质成分分离效果好，峰形理想，具有较高的灵敏度和精密度， 能够满足饲料中色氨酸的定量分析［23］。 赵艳等［9］通过测定鱼粉、豆粕样品中色氨酸含量建立了微波辅助蛋白质水解—反相高效液相色谱的方法，样品经微波碱水解后，采用C18色谱柱，以0.05 mol/L KH2PO4溶液—乙腈为流动相进行洗脱，二级阵列管（DAD）检测器在220 nm 处进行检测， 色氨酸线性相关系数为1.000 0，回收率93.0%～95.5%，RSD 为1.26%～2.72%，很好地解决了苯丙氨酸、 酪氨酸等带苯环氨基酸对色氨酸测定结果的干扰问题。李成成等［34］采用C18高效液相色谱柱分离麦麸、 玉米等饲料样品碱水解液，醋酸盐缓冲液和甲醇为流动相等度洗脱，DAD检测器在280 nm 波长检测； 标准曲线在25～500 mg/L 线性良好， 加标回收率为88.33%～105.04%，相对标准偏差也较小。 高效液相色谱法测定饲料中色氨酸含量具有方法准确、分析时间较短、灵敏度高等优点，适用于饲料中色氨酸大规模测定。

3.2 气相色谱仪

气相色谱法（gas chromatography，GC）是利用气体作为流动相的色层分离分析方法。 通过选择氯甲酸甲酯（MCF）、三氟乙酰（TFA）、五氟丙酰（PFP）、七氟丙酰（HFB）等作为衍生剂，将氨基酸衍生为易于气化的衍生物， 将气化后的氨基酸由气体流动相携带通过色谱柱， 通过与固定相结合能力的不同形成差速迁移， 从而实现各个氨基酸组分的分离，具有效能高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、应用广泛、操作简便等优点，但其衍生化反应容易受到干扰成分的影响［30］。因此，单独的GC 法在氨基酸的分析中应用并不多。相对于GC，气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）结合了气相色谱和质谱的特性， 将待测氨基酸样品在气相色谱仪中进行分离后直接导入质谱仪进行检测， 极大地提高了氨基酸定量分析效率［35］。

孟庆国等［36］将沼液作为饲料添加剂并研究其氨基酸含量，采用柱前衍生气相色谱法，联合质谱仪测定7 种沼液中包括色氨酸在内的18 种游离蛋白氨基酸含量，由于氨基酸R 基不同，各种氨基酸的化学性质也有较大差异， 测定多种不同属性的氨基酸存在一定困难；运用GC-MS 法分析多种不同氨基酸， 能够更为有效地分离色氨酸等不同种类的氨基酸，测定结果准确，回收率＞90%，且方法简便、低耗、重现性好。

3.3 毛细管电泳仪

毛细管电泳 （capillary electrophoresis，CE）是经典电泳技术和现代微柱技术结合的产物， 能在高压电场驱动下， 以内径仅25～100 μm 的毛细管为分离通道， 根据样品各组合之间电泳淌度或分配行为上的差异而实现分离目的的一类液相分离技术， 根据其分离组分特性不同可分为毛细管区带电泳、胶束毛细管电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等不同模式［37］。 毛细管电泳中使用的检测方法有光谱法、电化学法、电导法和质谱法，紫外可见光谱法最普遍。 该方法在3～30 min 内即可实现结果测定，具有分离效率高、分析速度快、所需样品量和溶剂消耗少、运行成本低、对环境污染小、灵敏度高、高度自动化等特点，已广泛应用于氨基酸分离及含量测定［38］。

《饲料中氨基酸的测定毛细管电泳法》（NY/T 3001—2016）中饲料样品经过盐酸水解后，经异硫氰酸苯酯溶液（PITC）衍生，再用毛细管电泳法进行分离和定量，但不适用于色氨酸测定［39］。俄罗斯标准《毛细管电泳法测定饲料、配合饲料及饲料原料中的蛋白氨基酸的含量》（GOST R 55569—2013）中饲料色氨酸含量测定：采用Ba（OH）2于110 ℃水解14～16 h 后， 不需衍生直接用硼砂缓冲液电泳并在219 nm 波长下测定色氨酸含量。 陶玉贵等［40］采用高效毛细管区带电泳法配套二极管阵列检测器对发酵液中L-色氨酸的含量进行了测定，通过对检测波长、缓冲液pH 值、缓冲液浓度、分离电压等测定条件进行筛选， 发现使用pH 值9.5、40 mmol/L 硼砂缓冲液，在25 kV 下电泳分离、210 nm 波长下检测L-色氨酸的测定结果最佳。毛细管电泳仪测定L-色氨酸的检测限为1.389 μmol/L，相对标准误差为3.308%，平均加标回收率为101.26%。 该方法具有准确度高、检测速度快等优点，可用于测定L-色氨酸的含量。 郗娟等［41］基于［Ru（phen）32+］-Ce（Ⅳ）化学发光体系，提出了毛细管电泳—化学发光联用技术检测复方氨基酸溶液中色氨酸的新方法。 在对电泳条件及柱后化学发光检测条件进行优化处理后， 该方法测定色氨酸的线性范围为5.0×10-7～2.0×10-5mol/L， 检测限为7.6×10-8mol/L， 出峰时间和电泳峰高的相对标准偏差分别为1.0%、4.7%，结果准确。

4 小结

随着人们对L-色氨酸的重视程度越来越高，用于色氨酸检测的众多技术，如前处理方法、光谱法、色谱法等在检测准确度、精密度、自动化测定方面不断革新。但也存在诸多问题，如在氨基酸的分离测定方法中， 采用分光光度及荧光法测定色氨酸含量灵敏度低、杂质干扰强，液相色谱法操作复杂、影响因素多，毛细管电泳法分辨率及选择性低，氨基酸自动分析仪昂贵、运行费用高。 色氨酸检测技术未来的研究趋势可以将多种检测技术融合、取长补短，开发普遍适用、准确快捷的饲料中色氨酸检测技术。