驴骨胶原肽制备方法的初步建立及分子量检测

2021-02-05付改玲刘厚霞刘永清李小波

畜牧与饲料科学 2021年1期

付改玲，刘厚霞，王娟，刘永清，李小波，夏敏

（内蒙古元本生物医药科技有限公司，内蒙古呼和浩特 010010）

我国是世界上驴存栏量最多的国家，年存栏量约为1 000 万头。驴的性情温顺、耐受力强、寿命长、采食量小，集药、补、食三大功能于一体。驴皮自古以来就有很高的药用价值，是制作“国药瑰宝”阿胶的主要原料。驴骨与驴皮含有同样的骨胶原蛋白肽类物质，具有与阿胶相同的补血养颜、调节肠胃功能、增强免疫力的功效［1-2］。驴骨还具有强筋健骨、防治骨质疏松症等功效［3］。

目前，动物骨胶原蛋白提取方面的研究主要集中在牛、羊、鸡、猪等动物［4-5］，而驴骨胶原蛋白多肽的研究与产品开发尚处于空白阶段。随着驴产业的发展越来越受到人们的关注，驴骨胶原肽产品的开发也成为提高驴产业附加值的一个重要方向。该研究旨在通过模拟人工胃肠环境，采用二级生物酶解技术提取驴骨胶原蛋白多肽，并对其分子量进行检测，以期为开发适合人体吸收分子量的驴骨胶原肽原料以及后续产品的研发提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

驴骨，呼和浩特市蒙驴食品有限公司提供；胃蛋白酶（10 万U/g）（货号：9001-75-6）、胰蛋白酶（4 000 U/g）（货号：T8151）、Tricine（货号：T8190），购自北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白（货号：PB10056），购自北京普博欣生物科技有限责任公司；福林酚（货号：73104861），购自国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺（货号：A108465-500 g）、N，N-亚甲基丙烯酰胺（货号：M104026-25 g），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巯基乙醇（货号：R049953-25 mL），罗恩试剂产品；Tris碱（货号：Amresco 0497），BIOSHARP 产品；小分子蛋白预染Marker（货号：26628），购自Thermo Scientific 公司；五水硫酸铜、氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钾、溴酚蓝、考马斯亮蓝R250、过硫酸铵、硫酸铵、无水乙醇、冰乙酸、尿素。

1.2 主要仪器设备

破骨机，胶体磨，骨泥磨，高压灭菌锅，培养箱，摇床，数显恒温水浴锅，离心机，双光束紫外分光光度计，TVE-1100 浓缩干燥机，BYGENE 电泳仪，超纯水机，移液枪。

1.3 试验方法

1.3.1 驴骨的预处理将新鲜的驴骨去除骨膜，剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜，经过破骨机破碎为5 cm 左右的小骨渣后送清洗机清洗。将清洗后的驴骨渣沥干、称重，于胶体磨和骨泥磨中制成驴骨泥（骨泥细度90～100 目），含水量60%～70%。脱脂［6-7］：取一定量的骨泥，加入2 倍纯化水，于高压灭菌锅内高温高压熬煮（121 ℃、45 min），去除上油层。脱钙［8］：将脱脂后的骨泥加入0.5%EDTA 溶液，浸泡24 h，100 r/min 搅拌，每8 h 更换1 次溶液，进行脱钙处理。

1.3.2 驴骨胶原肽的提取

1.3.2.1 一级酶解将脱脂、脱钙后的骨泥按1∶3（W∶V）的比例加入纯化水，模拟人工胃液，用2.0 mol/L 的盐酸溶液调节pH 值至2.5～3.0，加入不同比例（1.0%、2.0%、3.0%）的胃蛋白酶（占驴骨的百分比），按胃蛋白酶最适酶活性进行酶解处理，时间为1.5、2.0、2.5 h。升温至100 ℃，作用15 min，使酶灭活，得到一级酶解液。取样，用0.45 μm 的滤膜过滤，过滤液用于测定驴骨胶原肽含量。

1.3.2.2 二级酶解选取驴骨胶原肽含量较高的一级酶解液，模拟人工肠液，用磷酸盐缓冲液调节pH 值至7.5～8.0，加入不同比例（1.0%、2.0%、3.0%）的胰蛋白酶（占驴骨的百分比），（50±0.5）℃条件下酶解处理，时间为1.5、2.0、2.5 h。升温至100 ℃，作用15 min，使酶灭活，得到二级酶解液。

二级酶解后获得的酶解液10 000 r/min 离心20 min，取上清液，用0.45、1.0、3.0 μm 的滤膜分级过滤，得到驴骨胶原肽溶液。

1.3.3 驴骨胶原肽含量的测定

应用福林酚法测定驴骨胶原肽溶液的多肽含量。

1.3.3.1 对照品溶液的制备精密称取牛血清白蛋白对照品0.03 g，加水至100 mL，制成1.0 mL 含牛血清白蛋白0.3 mg 的溶液。

1.3.3.2 碱性铜溶液的配制取氢氧化钠10 g、碳酸钠50 g，加水400 mL 使其溶解，作为甲液。取酒石酸钾0.5 g 加水50 mL 使其溶解，另取硫酸铜0.25 g 加水30 mL 使其溶解，二者的混合液作为乙液。

临用前，合并两液，得到碱性铜溶液，加水至500 mL。

1.3.3.3 待检样品的制备取制备的驴骨胶原肽溶液1.0 mL 加入50 mL 量瓶，加水定容至50 mL，作为待检样品，做3 个平行。

1.3.3.4 标准曲线的绘制精密量取 “1.3.3.1”项下制备的对照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分别置于具塞刻度试管中，各加水至1.0 mL，再分别加入碱性铜溶液1.0 mL，摇匀，各加入福林酚试液4.0 mL，立即混匀，55 ℃水浴10 min，在650 nm波长处测定吸光度；以0 号管作为空白对照，以吸光度作为纵坐标、对照品溶液浓度作为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3.5 待检样品多肽含量的测定精密量取“1.3.3.3” 项下的驴骨胶原肽待检样品1.0 mL，测定在650 nm 波长处的吸光度，自标准曲线上查得待检样品溶液的多肽浓度，并乘以稀释倍数，即为所制备驴骨胶原肽溶液的多肽含量。

1.3.4 驴骨胶原肽分子量的测定［9-11］驴骨胶原肽分子量的测定采用SDS-PAGE法，步骤如下。

1.3.4.1 溶液的配制 30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29.0 g、甲叉双丙烯酰胺1.0 g，加蒸馏水定容至100 mL。阳极缓冲液：取Tris 12.11 g，加蒸馏水至500 mL，用盐酸调整pH 值至8.9，定容至500 mL。阴极缓冲液：取Tris 6.06 g，Tricine 8.96 g，SDS 0.5 g，加蒸馏水定容至500 mL。分离胶缓冲液：取Trisbase 180 g，加蒸馏水800 mL 溶解，用盐酸调整pH值至8.8，定容至1 000 mL。浓缩胶缓冲液：取Tris-base 60 g，加蒸馏水800 mL 溶解，用盐酸调整pH 值至6.8，定容至1 000 mL。样品缓冲液：取SDS 0.8 g，甘油4.0 g，β-巯基乙醇0.2 g，溴酚蓝0.01 g，加0.5 mol/L 的Tris-HCl（pH 值=6.8）溶解，并定容至10 mL。 25%过硫酸铵溶液：取过硫酸铵2.5 g，加蒸馏水定容至10 mL。 10%SDS 溶液：取SDS 10 g，加蒸馏水定容至100 mL。染色液：取考马斯亮蓝R250 2.5 g，无水乙醇400 mL，冰乙酸100 mL，加蒸馏水定容至1 000 mL。脱色液：取无水乙醇300 mL，冰乙酸100 mL，加蒸馏水定容至1 000 mL。

1.3.4.2 制胶采用BYGENE 垂直电泳仪附件模具，制成0.75 mm 厚的凝胶，分别制成20%分离胶、10%夹层胶、5%浓缩胶的梯度胶，各梯度凝胶配方见表1。3 种胶的制胶体积比为4.0∶1.5∶1.0，分离胶与夹层胶制成后，小心注入纯化水封胶，待胶聚合完全后，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

1.3.4.3 样品处理取2 mL 样品原液加入浓缩管，于试管浓缩仪中55 ℃、-80～-70 kPa 浓缩干燥成粉，得到浓缩样品。样品浓缩物中加入1 mL 上样缓冲液，热水煮沸5 min。

1.3.4.4 点样小分子预染蛋白Marker 与样品各点入15 μL，含小分子肽15 μg 左右。

1.3.4.5 跑胶前3 h 电压50 V、电流20 mA，后2 h 电压90 V、电流30 mA。

1.3.4.6 固定取胶加入固定液固定20 min，用纯化水反复清洗干净。

1.3.4.7 染色加入染色液染色30 min。

1.3.4.8 脱色弃去染色液，加入脱色液，在摇床上60 r/min 脱色40 min，用纯化水反复清洗干净。

1.3.4.9 结果观察用肉眼观察蛋白条带。

1.4 数据处理

人工胃液和肠液模拟条件下，不同加酶量和酶解时间作用后的一级、二级酶解驴骨胶原肽含量数据用“平均值±标准差”（Mean±SD）表示。利用SPSS 17.0 软件对试验数据进行方差分析，采用LSD 法进行多重比较。 P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

利用福林酚法测得不同浓度标准品牛血清白蛋白的吸光度。根据所测结果，以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图1），得到标准曲线方程：y=0.163 9x-0.149 6，R2=0.998 9。

图1 不同浓度牛血清白蛋白标准曲线

2.2 一级酶解驴骨胶原肽含量测定结果

由于一级酶解模拟的是人工胃液环境（pH 值在2.5～3.0），酶解反应条件以加酶量和酶解时间作为变量，酶解后驴骨胶原肽含量作为酶解率评价指标的因变量。应用福林酚法测得一级酶解驴骨胶原肽吸光度。根据标准曲线方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀释倍数，得出一级酶解驴骨胶原肽含量。应用SPSS 17.0 软件，对不同加酶量和酶解时间处理的一级酶解驴骨胶原肽含量进行方差分析和组间多重比较，结果见表2。由表2 可知，在相同酶解时间下，加酶量为2.0%和3.0%时，所得的一级酶解驴骨胶原肽含量均极显著（P＜0.01）高于加酶量为1.0%时的一级酶解驴骨胶原肽含量，而加酶量为2.0%和3.0%时所得的一级酶解驴骨胶原肽含量差异均不显著（P＞0.05），提示加酶量为2.0%和3.0%时获得的一级酶解驴骨胶原肽含量较高。当加酶量为2%和3%时，酶解2.0 h 和2.5 h 时所得的一级酶解驴骨胶原肽含量均极显著（P＜0.01）高于酶解时间为1.5 h 时的一级酶解驴骨胶原肽含量，而酶解2.0 h 和2.5 h 时所得的一级酶解驴骨胶原肽含量差异均不显著（P＞0.05），提示酶解时间为2.0 h 和2.5 h 时获得的一级酶解驴骨胶原肽含量较高。结合统计学分析结果，从保证酶解产物获得量、降低胃蛋白酶使用成本和缩短酶解时间的角度考虑，胃蛋白酶的最适添加比例为2.0%，最适酶解时间为2.0 h。由此可以得出，模拟人工胃液环境，应用胃蛋白酶进行一级酶解驴骨胶原肽的最适反应条件为：pH 值在2.5～3.0，加酶量2.0%、酶解时间2.0 h。

表1 不同浓度凝胶配方

2.3 驴骨胶原肽含量测定结果

选取最适一级酶解条件所得酶解液，模拟人工肠液环境（pH 值在7.5～8.0）进行二级驴骨胶原肽酶解，酶解反应条件及酶解评价指标与一级酶解相同。二级酶解液即为驴骨胶原肽溶液，应用福林酚法测得二级酶解驴骨胶原肽吸光度。根据标准曲线方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀释倍数，得出二级酶解驴骨胶原肽含量。应用SPSS 17.0 软件，对所得数据进行方差分析和组间多重比较，结果见表3。由表3 可知，在相同酶解时间下，加酶量为2.0%和3.0%时，所得的驴骨胶原肽含量均极显著（P＜0.01）高于加酶量为1.0%时的驴骨胶原肽含量，而加酶量为2.0%和3.0%时所得的驴骨胶原肽含量差异均不显著（P＞0.05），提示加酶量为2.0%和3.0%时获得的驴骨胶原肽含量较高。当加酶量为2.0%和3.0%时，酶解2.5 h 所得的驴骨胶原肽含量均显著（P＜0.05）高于酶解2.0 h 所得的驴骨胶原肽含量，且均极显著（P＜0.01）高于酶解1.0 h 所得的驴骨胶原肽含量，提示酶解2.5 h 时获得的驴骨胶原肽含量最高。结合统计学分析结果，从保证酶解产物获得量、降低胰蛋白酶使用成本和缩短酶解时间的角度考虑，胰蛋白酶的最适添加比例为2.0%，最适酶解时间为2.5 h。由此可以得出，模拟人工肠液环境，应用胰蛋白酶进行二级酶解驴骨胶原肽的最适反应条件为：pH 值在7.5～8.0，加酶量2.0%、酶解时间2.5 h。

2.4 驴骨胶原肽分子量测定结果

由图2 可知，通过二级生物酶解技术获得的驴骨胶原肽分子量在10 kDa 左右。

3 讨论

该研究针对内蒙古自治区牲畜骨骼资源利用不足，营养物质提取率低，且多在加工过程中使用酸性裂解等工艺，易造成环境污染等问题，探索了驴骨胶原肽的新型制备工艺。通过模拟人工胃肠液消化环境，建立了驴骨胶原肽二级生物酶解制备工艺及条件。首先将新鲜驴骨制成骨泥，脱脂、脱钙处理后，加水加酶，进行一级酶解。酶解条件为：添加2.0%胃蛋白酶（10 万U/g），pH 值在2.5～3.0，酶解时间2.0 h。一级酶解完成后，调节pH 值在7.5～8.0，添加2.0%胰蛋白酶（4 000 U/g），酶解时间2.5 h，即完成二级酶解。之后，利用SDSPAGE 法分析了二级生物酶解所得驴骨胶原肽的分子量，产物大小集中于10 kDa。综上表明，该研究在模拟人体胃、肠生理环境条件下，采用二级生物酶解制备方法可生产符合人体吸收和生物学作用的驴骨胶原肽。