幽门螺杆菌Acr AB-Tol C外排泵相关基因hefA/D/G在克拉霉素耐药性患者中的表达

余志辉

幽门螺杆菌是一种定植胃内的革兰阴性致病菌，为引起消化性溃疡和慢性胃炎的主要原因，因此被世界卫生组织(WHO)列为胃癌的一类主要病原菌[1]。感染幽门螺杆菌应使用抗生素根除治疗，否则感染可持续终身，因此有效地根除幽门螺杆菌感染具有重要的临床意义。目前治疗幽门螺杆菌的方法也不断发生变化，从早期标准三联疗法到目前的四联疗法、序贯疗法、伴同疗法和混合疗法，然而随着抗生素的广泛应用，幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性不断提高，尤其是对克拉霉素的耐药性，我国幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药性高达20%，幽门螺旋杆菌对抗生素耐药性已成为根除其最大的困难之一[2]。降低药物对抗生素的耐药性首先必须明确其耐药发生的机制。研究表明，细菌对克拉霉素耐性的一种重要机制为细菌23S rRNA中A2142G/A2143G的碱基突变，药物的作用靶点发生变化，细菌对克拉霉素产生耐药[3]。前期研究报道认为，革兰阴性耐药产生的机制与外排泵家族关系极为密切，其中Acr AB-Tol C被认为是许多细菌产生耐药特有机制之一[4]。研究报道，幽门螺旋杆菌中存在三种编Acr AB-Tol C外排泵的同源基因为hef A、hef D和hef G[5]。本研究分析幽门螺杆菌Acr AB-Tol C外排泵相关基因hefA/D/G对克拉霉素的耐药性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选取2018年3月-2019年12月因消化不良于佛山市第五人民医院就诊的患者303例，经过13C检测确认为幽门螺旋杆菌感染100例，行胃镜检查，男64例，女36例；年龄20～86(53.8±7.9)岁，排除实质性病变、胃肿瘤、胃炎及胃溃疡等器质性病变的患者，胃镜取组织活检。幽门螺旋杆菌对克拉霉素耐药性采用RT-PCR检测Hp23s rRNA基因V区A2142G和A2143G突变和克拉霉素药敏实验确诊是否耐药[6]，然后将100例患者依据是否耐药分为克拉霉素敏感组和克拉霉素耐药组。收集完毕样本后分析hef A、hef D和hef G mRNA表达差异。

1.2 试剂与仪器 TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、RNAiso Reagent Kit均购于大连宝生物公司，三氯甲烷、异丙醇等有机溶剂均采用分析纯试剂，7300 PCR仪购于ABI公司。

1.3 核酸提取 患者行胃镜检查取组织后进行RNA总提取。总RNA提取：取出组织后无酶PBS漂洗组织2次，用液氮研磨组织，待组织研磨成粉末状时，加入RNAiso Reagent Kit 1 ml至研磨后的组织中冰上静置10 min。收集裂解液加入1/5体积三氯甲烷混匀，13 000 rpm 4 ℃离心10 min。吸取上清液加入等体积的异丙醇，13 000 rpm 4 ℃离心10 min保留沉淀。使用75%乙醇漂洗，13 000 rpm 4 ℃离心10 min，弃上清后-80 ℃保存。

1.4 RT-real time PCR RNA逆转录为cDNA：使用TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit反转录试剂盒合成cDNA的混合体系：Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ 1.0 μl，Random 6 Primer (100 μM) 1.0 μl，Oligo dT Primer (50 μM) 1.0 μl，5×Prime ScriptTMBuffer 4 μl，20 μl的反应体系中去总RNA为1 000 ng，补RNase Free水至20 μl。反应条件：37 ℃ PCR中反应15 min，85 ℃ 5 s灭活反应体系，获得反应产物-20 ℃保存。PCR扩增检测所需要引物，依据本次实验的要求在genbank下载目的序列的mRNA，设计合成目的引物序列。hef A：Forward5′-CAGCTGGCGCTTATTTGGATAG-3′and Reverse5′-TTCCGCTTGGAGTTGTTGGGTG-3′；hef D：Forward5′-GCAGCACGCCTAGCCAATATCAA-3′and Reverse5′-ATTCCAAAGTTCGCTTCTC

GTTG-3′；hef G：Forward5′-GCAGCTTTATGATGCCTGAAATGC-3′and Reverse5′- GGAATTCCATTAAATTGGGCGAACTG-3′；16S rRNA：Forward5′-ACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′Reverse5′-GTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。Real time-PCR检测：按照Applied Biosystems公司7300 PCR仪器操作说明和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(2×)试剂盒的说明严格进行操作，此次PCR的反应体系为20 μl，PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，退火31 s，40个循环。 Real-time RT-PCR数据分析处理采用2-△△Ct处理数据[7]。

2 结 果

2.1 幽门螺旋杆菌感染率 消化不良患者303例中，幽门螺旋杆菌检测阳性100例(33.00%)。男女幽门螺旋杆菌感染率比较差异无统计学意义(χ2=1.090，P=0.296)。见表1。

表1 幽门螺旋杆菌感染结果

2.2 幽门螺旋杆菌耐药性检测 100例幽门螺旋杆菌患者中，总耐药率为39.00%。男女耐药率比较差异无统计学意义(χ2=0.045，P=0.833)。见表2。

表2 幽门螺旋杆菌耐药性检测分析结果

2.3 hefA/D/G mRNA PCR分析结果 克拉霉素耐药组hef A、hef D、hef G mRNA表达水平高于卡拉霉素敏感组(P<0.01)。见表3。

表3 hefA/D/G mRNA PCR分析结果

3 讨 论

幽门螺旋杆菌是一类胃内的革兰阴性致病菌，彻底清除幽门螺旋杆菌对胃部的健康和保护至关重要。幽门螺旋杆菌感染多发生在儿童时期，并且不能通过自身的免疫力自我清除。流行病学调查显示，幽门螺旋杆菌的感染与经济的发展程度及人们的生活习惯密切相关，感染率存在地区差异[8]。幽门螺旋杆菌感染后容易引起消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等相关胃实质性病变[9]。幽门螺旋杆菌感染患者必须及时治疗，但目前随着抗生素的广泛使用，细菌对抗生素的耐药性不断提高，尤其是幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药性不断提高，因此成为目前治疗幽门螺旋杆菌的一大难题[5]。目前治疗幽门螺旋杆菌的一线药物为枸橼酸铋钾、雷贝拉唑、阿莫西林及克拉霉素[10]，对克拉霉素耐药的患者需使用呋喃唑酮代替克拉霉素治疗。克拉霉素为大环内酯类抗生素，作用于幽门螺旋杆菌的23S核糖体抑制肽基酰基转移酶，抑制mRNA的合成，从而达到抑制细菌蛋白的合成，引起核糖体的构象发生变化，最终导致克拉霉素对其抑制的减弱[7]。研究显示，外排泵将药物排出体外是细菌的重要耐药机制之一，其中Acr AB-Tol C外排泵是革兰阴性细菌产生多种耐药最主要的机制之一[4]。研究表明，幽门螺旋杆菌含有编码Acr AB-Tol C外排泵系统相关基因，其中hef ABC、hef DEF 和hef GHI成为组成型的表达，hef A、hef D、hef G编码外膜通道蛋白依次扮演不同的功能[6]。本文研究表明hef A、hef D、hef G基因在克拉霉素耐药患者的中表达水平显著升高。

幽门螺旋杆菌感染后引起一系列的胃实质性的病变，然而我国幽门螺旋杆菌的感染率相对较高，因地区不同存在一定的差异，本文结果显示，幽门螺旋杆菌感染率为33.00%，其中感染患者无性别差异。目前根除幽门螺旋杆菌主要通过抗生素联合治疗，治疗过程容易产生耐药，尤其是对克拉霉素产生的耐药性，流行病学调查结果显示，我国克拉霉素的耐药性为20%～40%。本研究结果发现，总耐药率为39.00%，与文献的报道数据基本一致。目前，幽门螺旋杆菌的耐药机制是否与其组成型hef A、hef D、hef G的表达有关仍有争议，本文通过RT-real-time检测幽门螺旋杆菌感染100例，对克拉霉素耐药39例，对克拉霉素敏感61例，结果显示，幽门螺旋杆菌对克拉霉素耐药组hef A、hef D、hef G的mRNA表达水平显著高于克拉霉素敏感组，结果表明，幽门螺旋杆菌耐药性菌的细胞内外排泵的同源基因hef A、hef D、hef G表达水平升高，其表达升高加速了药物的外排，导致体内药物浓度降低，进而影响克拉霉素对幽门螺旋杆菌的抑制作用。

综上所述，幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药已成为根除其主要的困难之一，必须明确其耐药发生的机制，然后进行有效的治疗，以提高根除效率，预防胃实质性的病变。本研究结论表明，幽门螺旋杆菌耐药患者中外排泵的同源基因hef A、hef D、hef G表达水平升高，幽门螺旋杆菌对克拉霉素的耐药性与其细胞内外排泵关系极其密切，可能成为幽门螺旋杆菌耐克拉霉素发生机制之一。